Bouillon Microdilution In Vitro Screening: en nem og hurtig metode til at registrere nye svampedræbende stoffer
Summary
En let og smidig bouillon microdilution metode til screening svampedræbende stoffer og ekstrakter.
Abstract
Svampeinfektioner i de sidste årtier er blevet en vigtig medicinsk tilstand, men antallet af tilgængelige svampemidler er begrænset. I dette scenario er søgningen efter nye svampemidler nødvendige. Protokollen rapporteret her beskriver en metode til skærmen peptider for deres svampedræbende egenskaber. Det er baseret på bouillon microdilution modtagelighed test fra de kliniske og laboratorium standarder Institute (der) M27-A3 retningslinjer med ændringer der passer til forskning af antimikrobielle peptider som potentielle nye svampemidler. Denne protokol beskriver en funktionel analyse for at vurdere aktiviteten af svampedræbende stoffer og let kan ændres så de passer til en bestemt klasse af molekyler under undersøgelsen. Da assays udføres i 96-brønd plader ved hjælp af små mængder, kan en omfattende screening fuldføres i en kort tid, især hvis udført i en indstilling for automatisering. Denne fremgangsmåde viser, hvordan en standardiseret og justerbar klinisk protokol kan hjælpe bænk-arbejde udøvelse af nye molekyler til at forbedre behandling af svampesygdomme.
Introduction
Svampeinfektioner er blevet en vigtig medicinsk bekymring i de seneste årtier, har betydeligt øget hovedsagelig skyldes en stigning i antallet af immunkompromitterede personer som dem, der undergår kræftbehandling og dem, der lever med HIV/AIDS eller transplanteres organer1,2. Men en meget begrænset vifte af tilgængelige svampemidler og det stigende antal rapporter om svampe modstand mod dem bidrage til de store problemer vedrørende therapeutics af systemisk mycoses3.
En potentiel kilde til nye svampedræbende stoffer er antimikrobielle peptider (AMP’er), lille kationiske peptider produceret af mange organismer som en del af deres medfødte immun reaktion på infektion4. Ikke desto mindre er screeningsmetode til at teste disse forbindelser mod svampe patogener ikke standardiseret. Forskellige procedurer har anvendt til at vurdere de svampedræbende aktivitet af ampere, nogle gange for den samme model mikroorganisme5,6,7. Disse forskelle og manglen på detaljer i nogle protokoller komplicere sammenligninger mellem forbindelser og hæmmer reproducerbarhed.
En måde at standardisere afprøvning af nye lægemiddelkandidater er at følge retningslinjer bruges til at definere svampedræbende modtagelighed i klinisk indstillinger, som kliniske og laboratorium standarder Institute (der) M27-A3 retningslinjer. Men disse svampedræbende følsomhed test er for restriktiv, og tager ikke hensyn variation i stofskiftet på tværs af arter, som de kun blev etableret for et par udvalgte agenter. For eksempel, tager de ikke hensyn ikke-gæring Gær metaboliske behov.
Denne protokol giver mulighed for vurdering af aktivitet af potentielle svampedræbende stoffer, og er implementeret her for søgning efter svampedræbende peptider. Det er baseret på bouillon microdilution modtagelighed test fra retningslinjerne der M27-A3 med ændringer, optimerer screeningen af nye forbindelser8,9. Disse ændringer giver mulighed for brug af små mængder af sammensatte, variationer i temperatur eller indledende inokulum og forskellige medier for optimal pre-test vækst, samtidig med at standardisere resultater med brug af reference svampemidler som kontrol. Denne metode med brug af flere godt kultur plader, gør det muligt at hurtigt og pålideligt skærmen et stort antal forbindelser.
På grund af dens iboende fleksibilitet, kan denne protokol bruges med forskellige kemiske klasser af forbindelser og mod andre mikroorganismer, med nogle tilpasninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution tests kan analysere den potentielle svampedræbende aktivitet af et sammensat ved hjælp af små mængder af sammensat mål og samtidig prøve det i en række koncentrationer. Derfor kan denne protokol anbefales som et første skridt i forbindelse med screening for potentielle nye svampedræbende stoffer. Protokollen præsenteres her er baseret på M27-A3-protokollen, oprindeligt designet til at støtte i udvælgelsen af svampedræbende terapi i klinikker, og kan tilpasses til en lang række nye svampedræb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker KAPPER-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF for finansiel støtte. Vi er taknemmelige for Dr. Hugo Costa Paes for revision af håndskriftet.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
