Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds
Summary
Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.
Abstract
Schimmelinfecties zijn een belangrijke medische voorwaarde geworden in de laatste decennia, maar het aantal beschikbare antischimmel geneesmiddelen is beperkt. In dit scenario is het zoeken naar nieuwe antischimmel geneesmiddelen nodig. Het protocol gemeld hier gegevens een methode om scherm peptiden voor hun schimmeldodende eigenschappen. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met wijzigingen aan het onderzoek van antimicrobiële peptiden als potentiële nieuwe antischimmelmiddelen. Dit protocol beschrijft een functionele test om te evalueren van de activiteiten van antischimmel verbindingen en kan eenvoudig worden aangepast om aan te passen van een bepaalde categorie van moleculen onder onderzoek. Aangezien de testen worden uitgevoerd in 96-wells-platen met behulp van kleine volumes, kan een grootschalig onderzoek worden uitgevoerd in een korte hoeveelheid tijd, vooral als uitgevoerd in een omgeving van automatisering. Deze procedure laat zien hoe een gestandaardiseerde en verstelbare klinische protocol het nastreven van de Bank-werk van nieuwe moleculen ter verbetering van de therapie van schimmelziekten kan helpen.
Introduction
Schimmelinfecties zijn geworden een belangrijke medische zorg in de afgelopen decennia aanzienlijk is gestegen voornamelijk te wijten aan een stijging van het aantal immuungecompromitteerde personen zoals die in de behandeling van kanker en degenen die met HIV/AIDS leven of getransplanteerde organen1,2. Echter bijdragen een zeer beperkt scala van beschikbare antischimmel geneesmiddelen en het toenemende aantal verslagen over schimmel weerstand tegen hen aan de grote problemen met betrekking tot de therapeutiek van systemische mycoses3.
Een potentiële bron van nieuwe antischimmel compounds zijn antimicrobiële peptiden (ampère), kleine kationische peptiden geproduceerd door vele organismen als onderdeel van hun aangeboren immune reactie op infectie4. De screeningsmethode voor het testen van deze verbindingen tegen schimmel ziekteverwekkers is echter niet gestandaardiseerd. Verschillende procedures zijn gebruikt om de antischimmel activiteiten beoordelen van versterkers, soms voor de dezelfde model micro-organisme5,6,7. Deze verschillen en het gebrek aan detail in sommige protocollen bemoeilijken vergelijkingen tussen verbindingen en belemmert reproduceerbaarheid.
Unidirectioneel om te standaardiseren het testen van nieuwe drugkandidaten is richtsnoeren gebruikt om te definiëren antischimmel gevoeligheid in klinische instellingen, zoals de klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren te volgen. Deze antischimmel gevoeligheid tests zijn echter te beperkend, en niet rekening overweging variatie in metabolisme over soorten, als zij slechts voor een paar selecteren agenten waren gevestigd. Bijvoorbeeld, doen ze niet rekening houden met de metabolische behoeften van niet-fermenteren-gisten.
Dit protocol staat de beoordeling van de activiteit van potentiële antischimmel verbindingen, en hier is geïmplementeerd voor het zoeken naar antischimmel peptiden. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de CLSI M27-A3-richtlijnen met betrekking tot wijzigingen die de screening van nieuwe verbindingen8,9te optimaliseren. Deze wijzigingen toestaan voor het gebruik van kleine hoeveelheden van stof, variaties in temperatuur of eerste entmateriaal en verschillende media voor optimale pre-test groei, terwijl de resultaten met het gebruik van referentie antischimmelmiddelen als besturingselementen te standaardiseren. Deze methode, met het gebruik van multi goed cultuur platen, maakt het mogelijk om snel en betrouwbaar scherm een groot aantal verbindingen.
Als gevolg van de inherente flexibiliteit, kan dit protocol worden gebruikt met verschillende chemische klassen van samenstellingen en tegen andere micro-organismen, met enkele aanpassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution tests kunnen analyseren van de potentiële antischimmel activiteit van een doel samengesteld met behulp van kleine hoeveelheden van de stof, en tegelijkertijd testen in een aantal uiteenlopende concentraties. Dienovereenkomstig, dit protocol wordt aanbevolen als een eerste stap in de screening voor potentiële nieuwe antischimmel compounds. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de M27-A3-protocol, in eerste instantie ontworpen om te helpen bij de keuze van antifungale therapie in klinieken, en ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de CAPES-Brazilië, CNPq-Brazilië, FAP/DF voor financiële steun. Wij zijn dankbaar aan Dr Hugo Costa Paes voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
