在这里, 我们提出了一个研究植物生长行为的协议, 特别是表型以可重现的方式。我们展示如何提供可变和在同一时间稳定的光条件。正确的分析取决于足够的样本数和有效的统计评价。
植物生物学家经常需要观察他们所选择的物种的生长习性。为此, 植物需要恒定的环境和稳定的光条件, 这是最好的数量和质量变量, 以便在不同的设置可以进行研究。这些要求由具有发光二极管 (LED) 灯的气候室满足, 它可以与荧光灯形成不同的波长。发光二极管是能量守恒, 即使在光强度下也几乎不发出热量, 这通常构成了其他光源的问题。该协议提供了一步一步的指导, 如何规划一个气候室装有可变 LED 灯, 以及描述几种方法, 深入分析的增长表型。根据试验装置的不同特性, 可以观察和分析生长中的植物。在这里, 我们描述了如何确定新鲜的重量, 叶面积, 光合活性和气孔密度。我们证明, 为了获得可靠的数据和得出有效的结论, 必须使用足够数量的个人进行统计评估。用太少的植物进行这种分析会导致高的统计误差, 因此对数据的解释不太清楚。
在二十多年的时间里,拟南芥一直是分子时代植物研究人员的模型有机体。几个特点使这个小代表的芸薹家族的理想候选基因和分子研究: 它有一个相对较小的基因组, 只有五染色体 (相比,如烟草烟草与24染色体) 和它的基因组在 2000年1中被完全测序。A. 南芥可以很容易地通过农杆菌病感染2进行基因改造, 甚至能够使用最新的基因工具, 如 CRISPR/Cas3。虽然小, 生长周期是足够快, 使生物化学实验是可行的, 在需要更大量的材料。植物生长在琼脂板材或在土壤和可以甚而耕种作为液体文化4。拟南芥可在高潮控制的碗柜中生长,例如, 来自波斯富, 在气候室或温室中。为了能够比较生长行为和分析突变体的表型, 这是至关重要的提供可重现性和同时灵活的增长条件5。根据将被解决的科学问题你可能需要不同的温度和恒定的光条件, 不同的光强度或不同的光质量在同一温度。光是植物生长的一个非常关键的参数, 它的影响在不同的方法中经常被研究6。为了确保获得的数据的可重复性和可比较, 确保稳定的输出并应用相同类型的光源是至关重要的。
温室和气候室通常的光源由钠蒸气或荧光灯组成, 它们促进了植物的生长, 但有几个缺点。首先, 他们的年龄随着时间的推移, 改变了光谱输出不仅在强度, 但在质量 (自己的观察)。然而, 只有强度通常是连续监测的, 所以光质量的变化可能会被忽视, 但仍然有显著的影响。第二, 两种类型的灯具在较高的光照强度下产生热量, 这本身对植物生长有深刻的生理影响, 并可能掩盖任何光的依赖性效应。第三, 这些光源的光谱输出是不变的, 很不像自然的阳光7。所有这些缺点都已在 led 的情况下被克服8,9,10,11。它们的寿命很长, 几乎没有任何变化, 即使在极高的光强下也不会产生废热, 它们在光谱输出方面非常灵活。
在这里, 我们说明了如何建立一个气候室, 分别为红色, 蓝色和白色光的 LED 灯, 并遵循不同的植物生长参数随着时间的推移。我们测量新鲜的重量, 叶面积, 气孔密度, 和光合性能。同时, 我们也展示了正确设置统计评价的重要性。
研究植物生长的第一步是根据所需条件建立气候室。通过将所有变量键入相应软件的程序掩码 (图 1A), 可以轻松完成此操作。在这一步, 许多修改可以通过改变光的制度和/或温度来实现。确保不断监视温度、湿度和光照条件 (图 2), 以防止技术故障破坏实验。这是获取可重现结果的关键点。虽然这种设置提供了许多变量, 可以灵活地调整, 但它有其局限性。目前可用的 LED 灯无法模拟阳光 100%, 气候室内的气候条件永远无法完全反映出15外部发生的情况。
与广泛使用的荧光灯相比, LED 灯更多功能, 需要更少的能量, 而且几乎不显示热辐射。这些优势导致了大工业的室内农业装备气候室和温室与 led16。考虑到这一领域的巨大成功, LED 技术肯定会找到更多的应用。
当观察表型, 特别是对叶面积的测定时, 重要的是要考虑到在较老的植物叶子重叠 (图 3)。因此, 整个花环的图形化评价往往不精确。在这种情况下, 它是更准确的切掉所有的树叶, 并从那里去。
在不同条件下, 对生长行为的评价, 特别是生长发育的差异, 取决于样本大小是否足够。在这项研究中, 至少有六株植物用于测定例如光合产量 (图 5)、鲜重 (图7) 和叶面积 (图 8A), 但在该研究开始时种植了30个人种子, 以确保首先, 足够的种子发芽, 第二, 可以选择 “典型的” 植物。即使在相同的种群中, 在相同的条件下, 在同一托盘中的单盆中, 也有不同的表型. 这当然反映在统计分析期间的标准偏差中, 但是当观察到小的统计错误 (图 8B) 时, 数据的解释通常更可靠。
通过 PAM (图 4,图 5) 可以对几个参数进行光合性能的测量。在这种情况下, 重点是 PSII 屈服 Y (II) 为例, 但也可以确定例如非光化学猝灭、调节和非调节的能量耗散或光缓解的量子屈服。重要的是选择至少五 AOIs 每叶均匀分布在叶片表面, 然后测量至少六叶从不同的植物。这种方法的缺点是不能检测到对 PSI 的任何影响;为此目的, 需要不同的设备。
The authors have nothing to disclose.
傅承认, Rhenac 绿色科技股份公司的支持, 通过本研究的部分。从 DFG (SFB TR175) 获得了资金。
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |