En metode for Holme transplantasjon til Omentum i mus
Summary
En metode for omental transplantasjon av holmer i en mus er innført. De isolerte småøyer er blandet med hydrogel og blandingen er plassert i den omental posen diabetiker museklikk. Deretter blodsukker overvåkes og immun-histochemical analyse er utført.
Abstract
Holme transplantasjon har blitt foreslått å være en potensiell behandling for type 1 diabetes. Siste overbevisende bevis indikerer at intravascular Holme infusjon er langt fra ideell og derfor omentum re-voksende som potensielt verdifulle nettsted for Holme transplantasjon. Dette eksperimentet krever isolering av høy kvalitet holmer og implantering av øyene til diabetiker mottakerne. Transplantasjon til omentum krever kirurgisk trinn som kan påvises bedre visuelt. Her presenteres detaljerte trinn for denne prosedyren. To metoder for å blande de isolerte småøyer med hydrogel før du plasserer blandingen inn i omental poseen diabetiker mus er beskrevet her. Forskjellige hydrogels brukes for ulike forhold. Blodsukker diabetiker musen mottakere av syngeneic holmer i omentum var overvåket for opp til 35 dager. Noen dyr ble ofret etter 14 dager å utføre immuno-histochemical analyse. Denne pre-klinisk transplantasjon kan brukes som foreløpige data fører til oversettelse til kliniske transplantasjon.
Introduction
Ifølge International Diabetes Federation (IDF), påvirker diabetes mellitus for tiden 382 millioner mennesker, med en projisert økning 592 millioner mennesker av 20351. Begge allogene og xenogeneic Holme transplantasjon er systemisk suppressive terapi nødvendig. Uten immunsuppresjon er uimottakelig avvisning en viktig årsak til graftet tap2. Det er også et betydelig problem av transplantert Holme tap på grunn av umiddelbar blod mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR)3,4. Men selv i fravær av en immunrespons som syngeneic eller auto-transplantasjon modeller, Holme celler transplantert inn i leveren via portalen blodåre går tapt på grunn av betennelse og/eller ugunstige miljøforhold, som fattig blod gi redusert oksygenering og/eller næringsstoffer5,6. Som et resultat for å sikre langsiktig metabolsk funksjon, er høyere Holme tallene nødvendig for å kompensere for den første celle tap som reduserer engraftment7.
I et forsøk på å optimalisere Holme engraftment, flere alternative anatomiske nettsteder har blitt undersøkt eksperimentelt samt med lovende, ennå ikke endelige resultater klinisk8. Mens noen av webområdene alternativ tilbyr enkel og trygg tilgang (f.eks., hud, nyre kapsel, gastrisk submucosa og fremre kammer av øyet) eller en større overflate for større Holme massene (f.eks., bukhulen), overlevelse og fysiologiske Metabolsk ytelsen av transplanterte øyene er fortsatt begrenset og forblir en bekymring9. Søk etter et mer egnet sted for Holme engraftment pågår.
Omentum var blant de mange anatomiske nettstedene som ble undersøkt i den tidlige utviklingen av Holme transplantasjon, og viste en fremgangsrik for holmer10,11,12,13, 14. Men intraportal Holme infusjon ble klinisk valg forfaller delvis relative enkelhet prosedyren og tidlig suksess på dyr modeller6. Også delvis negativer forbundet med dette området, spesielt massive tidlig Holme tap, var mindre forstått og mindre begrensende i begynnelsen av eksperimentelle Holme transplantasjon som feltet modnet. Med nyere overbevisende bevis indikerer at intravascular Holme infusjon er langt fra ideell, omentum er re-voksende som potensielt verdifulle nettsted for cellen transplantasjon.
Omentum (i form av en omental posen) har relative fordeler over leveren15,16. Det er godt vascularized og lett tilgjengelig. Den lar henting av pode (om nødvendig) eller biopsi. Den iskemiske perioden oppleves av øyene er redusert sammenlignet med leveren, og omentum kan godta relativt store Holme massene som ikke mulig intraportally, der en økning i portalen press kan føre til komplikasjoner.
En syngeneic musemodell av transplantasjon ble brukt i protokollen testet i studien, ansette C57BL/6 mannlige mus mellom 6-8 uker gammel med en kroppsvekt på 20-25 g. Holme mottakere ble gjengitt diabetiker med en enkelt injeksjon av streptozotocin med en dose av 250 mg/kg ip. Induksjon av diabetes kan betraktes vellykket hvis blodsukkernivå museklikk er større enn 24 mmol/L 48 timer etter injeksjon og forblir nivået i minst 5 dager over.
Syngeneic holmer ble isolert fra bukspyttkjertelen alder-matchet givere fulgte publisert tidligere metoder med noen modifikasjoner. I korte trekk ble collagenase injisert i galleblæren i stedet for gallekanalen. Dette ble gjort som en forbedring å lette enkel injeksjon. Collagenase infusjon var etterfulgt av inkubering, vev avbrudd, tetthet gradert separasjon og håndplukke å få ren holmer. Holmer ble kultivert overnatting i CMRL-1066 medium supplert med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) i T175 flasker på 37 ° C, under 95% luft – 5% CO2 før transplantasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Holme transplantasjon til leveren via portalen blodåre er mest brukte metoden for Holme transplantasjon hos mennesker, men det er fortsatt effektivitet og sikkerhet bekymringer som portalen blodåre tromboser og lever Steatose17. Nyere studier viser at omentum kan være et egnet alternativ til leveren, men mer forskning må gjennomføres før kliniske oversettelse12,14,18,19<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noen av forfatterne av dette arbeidet ble støttes delvis av tilskudd fra nasjonale nøkkel R & D Program i Kina (2017YFC1103704), Sanming prosjektet medisin i Shenzhen (SZSM201412020), fondet for høyt nivå medisinsk disiplin konstruksjon i Shenzhen (2016031638), Shenzhen grunnlaget for vitenskap og teknologi (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen grunnlaget for helse og familieplanlegging Commission (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
