Size Matters: Måling af kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans
Summary
Polysaccharid kapsel er den primære virulens faktor i Cryptococcus neoformans, og dens størrelse korrelerer med stamme virulens. Kapsel diameter målinger bruges i fænotypiske test og til at måle terapeutiske virkning. En standardmetode til kapsel induktion præsenteres her, og to metoder til farvning og måling diameter sammenlignes.
Abstract
Polysaccharid kapsel af Cryptococcus neoformans er den primære virulens faktor og en af mest studerede almindeligt aspekter af denne patogene gær. Kapsel størrelse kan variere meget mellem stammer, har evnen til at vokse hurtigt, når introduceret til stressende eller lave næringsstof betingelser, og er blevet positivt korreleret med stamme virulens. Af disse grunde er størrelsen af kapslen af stor interesse for C. neoformans forskere. Vækst af C. neoformans kapsel er induceret under fænotypiske test til at hjælpe med at forstå virkningerne af forskellige behandlinger på de gær eller størrelse forskelle mellem stammer. Her beskriver vi en af de standard metoder af kapsel induktion og sammenligne to anerkendte metoder til farvning og måling kapsel diameter: a tusch, en negativ pletten, anvendes i forbindelse med konventionelle lysmikroskopi og (ii) Co-farvning med fluorescerende farvestoffer cellevæg og kapsel efterfulgt af Konfokal mikroskopi. Endelig vil vi vise hvordan måling af kapsel diameter fra Indien blækplettede prøver kan være automatiseret ved hjælp af computational billedanalyse.
Introduction
Påvirker en kvart million mennesker hvert år og resulterer i mere end 180.000 dødsfald om året, er Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulære gær og det agens af cryptococcosis1,2, 3. hårdest ramt er HIV-positive patienter i de fattige lande, der ikke har adgang til antiretroviral behandling, hvilket gør dem meget modtagelige for sygdom4,5,6. Data fra CDC viser, at i Sahara, C. neoformans dræber flere mennesker end tuberkulose årligt og mere hver måned end nogen Ebola-udbrud på post1. Den mest almindelige eksponeringsvej for opstår fra indånde udtørret sporer, der er almindeligt forekommende i miljøet7. Ved ankomsten til lungerne, er der flere virulens faktorer, der bidrager til succes af C. neoformans inden for inficerede individer. Polysaccharid kapsel anses mikrobes primære virulens faktor, da acapsular stammer ikke er ondartet8.
Cryptococcal kapslen er sammensat af tre princippet komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), og mannoproteins (MPs)9. MPs er et relativt mindre cellevæg-forbundet komponenten af kapslen, de er immunogen og kan fremme en overvejende pro-inflammatoriske respons9,10. I modsætning hertil er GXM og GalXM udgør hovedparten af kapslen (> 90% efter vægt) og har immunosuppressive effekter11. Ud over sin immunmodulerende effekt skaber den hurtige udvidelse af kapsel i vivo en mekanisk barriere for indtagelse af vært fagocyterende celler (dvs., neutrofiler og makrofager)12. C. neoformans kapsel og sin Sammenfattende er komplekse, men generelt, øget kapsel diameter er korreleret med øget virulens6,13,14. I betragtning af dette, er det vigtigt for C. neoformans forskere til at være i stand til hurtigt og nøjagtigt kvantificere kapsel målinger.
Både C. neoformans cellen og dets polysaccharid kapsel er dynamiske strukturer og Vis ændringer over tid15. Kapslen kan ændre i tæthed, størrelse og forsamling som svar på ændringer i vært miljø16,17,18. Lavt jern eller næringsstof niveauer, eksponering for serum, den menneskelige fysiologisk pH og øget CO2 er kendt for at indlede kapsel vækst16,18,19,20. Yderligere, har forskere vist strukturelle ændringer resulterer i betydelige forskelle i immunoreactivity under en infektion, udlån en fordel til C. neoformans over sin vært21,22. Dette er kendt fordi arkitektur af C. neoformans kapsel er blevet analyseret i en række forskellige måder. Elektronmikroskopi, for eksempel, har afsløret at kapslen har en heterogen matrix med en indre elektron-tætte lag nedenunder en ydre, mere gennemtrængelige lag23. Lysspredning og brugen af optiske tweezers har tilladt forskere til yderligere belyse dens makromolekylære egenskaber24. Analysere resultaterne fra både statisk og dynamisk lysspredning målinger, ved vi, at polysaccharid kapsel har en kompleks forgrening struktur23. Optisk pincet har været brugt til at teste stivheden struktur samt vurdere dens antistof reaktivitet24. Men langt den hyppigst ansat analyse af C. neoformans kapsel er måling af dens størrelse.
For at kvantificere kapsel størrelse, forskere bruger hvad der bør være en simpel måling: lineær diameteren af kapslen. Digital mikroskoper er brugt til at fange billeder af flere C. neoformans celler (generelt hundredvis) farves med tusch eller fluorescerende farvestoffer. Størrelsen af hver celle organ og omkringliggende kapsel er målt. Data er indsamlet, og den gennemsnitlige diameter af kapslen er beregnet ved at fratrække cellen kroppen diameter fra hele cellen diameter (cellen kroppen + kapsel). Indtil dette tidspunkt, er disse målinger blevet gjort manuelt. Mens generelt præcis, har denne metode ulemper for forskere. Store datasæt kan tage dage eller endda uger til at analysere i hånden. Og fordi disse målinger er udført manuelt, subjektivitet og menneskelige fejl kan påvirke resultatet.
Automatiseret beregningsmæssige billedanalyse er blevet et uundværligt redskab for forskere i mange områder af Molekylær cellebiologi, muliggør hurtigere og mere pålidelig analyse af biologiske billeder 25,26,27. Præcise billede analyseteknikker er nødvendige for at mine kvantitative oplysninger fra hvad er ofte komplekse og enorme datasæt. Nogle målinger, især måling af C. neoformans kapsel, har dog været vanskeligt at automatisere. Præcist identificerer grænsefladen mellem cellevæg og kapsel, der normalt vises som en mørk ring når afbildet af fasekonstrastmikroskopi, kan være besværlige at løse ved hjælp af en simpel tærskel. Yderligere, C. neoformans celler i kultur har tendens til at klumpe sammen og præcis segmentering af celler er nødvendige for nøjagtige målinger.
Formålet med dette projekt var at (i) illustrere en af standardprotokoller til kapsel induktion i C. neoformans, (ii) Sammenlign og kontrast tusch og fluorescens farvning som de gælder for at kapsel diameter målinger, (iii) udvikle simple, beregningsmæssige metoder til at måle kapsel diameter ved hjælp af billeder af Indien blæk farves celler ved hjælp af et billede analyse software og (iv) vurdere fordele og begrænsninger af måling kapsel diameter manuelt og ved hjælp af software automatisering. Vi finder, at de to farvning metoder, fluorescerende, mærkning af cellevæggen og kapsel, mens mere tidskrævende, forudsat de mest konsistente resultater mellem eksperimenter. Men begge metoder aktiveret os til at kunne skelne mellem lab og kliniske C. neoformans kapsel stammer udstiller forskellige størrelser. Yderligere, vi var i stand til at automatisere måling af kapsel diameter fra Indien blæk farves billeder og fandt, at dette var et levedygtigt alternativ til manuel måling af kapsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I årtier været kapslen større fokus på forskningsområdet for både mycologists og klinikere interesseret i C. neoformans og cryptococcosis på grund af sin rolle som en større virulens faktor for patogenet. Ved hjælp af mikroskopi til at måle forskelle i kapsel størrelse mellem stammer og under forskellige vækst betingelser kan give vigtige oplysninger om patogenet og sine reaktioner på forskellige stimuli (dvs., forskellige miljøforhold, potentielle lægemiddelsbehandlinger m.m.)he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Molekylær biovidenskab (MOBI) ph.d.-program og departementet biologi på Middle Tennessee State University (MTSU) for at yde støtte til denne undersøgelse. Projektet var også delvis finansieret af særlige projekter tilskud tildeles D.E.N. af MTSU Foundation.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
