Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans
Summary
Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l’efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.
Abstract
Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.
Introduction
Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l’agente causativo di dermatosi da criptococco1,2, 3. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record1. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente7. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti8.
Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)9. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi11. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l’ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)12. La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.
Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di15. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell’host ambiente16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l’esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO2 sono noti per avviare la crescita capsula16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un’infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito21,22. Questo è noto perché l’architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile23. Dispersione della luce e l’uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari24. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione23. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell’anticorpo24. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.
Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l’inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l’errore umano può influenzare il risultato.
Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l’analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini 25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l’interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.
Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell’inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l’agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l’agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il programma di dottorato di scienze biologiche molecolari (MOBI) e il dipartimento di biologia a Middle Tennessee State University (MTSU) per fornire i finanziamenti per questo studio. Il progetto è stato inoltre finanziato in parte da una sovvenzione di progetti speciali per D.E.N. dalla Fondazione MTSU.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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