आकार मामलों: कैप्सूल व्यास का माप Cryptococcus neoformans में
Summary
polysaccharide कैप्सूल Cryptococcus neoformans में प्राथमिक डाह कारक है और इसका आकार तनाव डाह के साथ संबद्ध है । कैप्सूल व्यास माप phenotypic परीक्षण में उपयोग किया जाता है और चिकित्सीय प्रभावकारिता गेज करने के लिए. यहां कैप्सूल प्रेरण की एक मानक विधि प्रस्तुत की है, और धुंधला और माप व्यास के दो तरीकों की तुलना कर रहे हैं ।
Abstract
Cryptococcus neoformans के polysaccharide कैप्सूल प्राथमिक डाह कारक और इस रोगजनक खमीर के सबसे अधिक अध्ययन किया पहलुओं में से एक है । कैप्सूल आकार उपभेदों के बीच व्यापक रूप से भिंन हो सकते हैं, तेजी से विकसित करने की क्षमता है जब तनावपूर्ण या कम पोषक तत्वों की स्थिति के लिए शुरू की है, और सकारात्मक तनाव डाह के साथ संबद्ध किया गया है । इन कारणों से, कैप्सूल का आकार C. neoformans शोधकर्ताओं के लिए बहुत रुचि का है । सी. neoformans कैप्सूल की वृद्धि phenotypic परीक्षण के दौरान प्रेरित खमीर या तनाव के बीच अंतर आकार पर विभिंन उपचार के प्रभाव को समझने में मदद करता है । यहाँ हम कैप्सूल प्रेरण के मानक तरीकों में से एक का वर्णन और दाग और माप कैप्सूल व्यास के दो स्वीकृत तरीकों की तुलना: (i) भारत स्याही, एक नकारात्मक दाग, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया और (ii) सह के साथ धुंधला दोनों सेल दीवार और कैप्सूल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा की फ्लोरोसेंट रंजक । अंत में, हम भारत स्याही से कैप्सूल व्यास की माप कैसे दिखाते हैं-सना हुआ नमूनों गणनात्मक छवि विश्लेषण का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है.
Introduction
एक चौथाई लाख लोगों को हर साल प्रभावित और अधिक से अधिक १८०,००० मौतों में जिसके परिणामस्वरूप, Cryptococcus neoformans एक रोगजनक, intracellular खमीर और प्रेरणा का एजेंट है cryptococcosis1,2, 3. सबसे मुश्किल हिट गरीब देशों में एचआईवी पॉजिटिव रोगियों जो एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा के लिए तैयार पहुंच नहीं है, उंहें तीव्रता से बीमारी4,5,6के लिए अतिसंवेदनशील बना रहे हैं । सीडीसी से डेटा संकेत मिलता है कि उप में सहारा अफ्रीका, सी neoformans प्रतिवर्ष और अधिक क्षय रोग से अधिक लोगों को मारता है और हर महीने रिकॉर्ड1पर किसी भी Ebola प्रकोप से । जोखिम का सबसे आम मार्ग शुष्क बीजाणुओं कि पर्यावरण में आम है7श्वास से होता है । फेफड़ों में प्रवेश करने पर, वहां कई डाह कारकों है कि संक्रमित व्यक्तियों के भीतर सी. neoformans की सफलता के लिए योगदान कर रहे हैं । polysaccharide कैप्सूल सूक्ष्म जीव के प्राथमिक डाह कारक माना जाता है, के रूप में acapsular उपभेदों विषमय 8 नहीं हैं ।
cryptococcal कैप्सूल तीन सिद्धांत घटकों से बना है: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), और mannoproteins (एमपीएस)9. जबकि सांसद एक अपेक्षाकृत छोटे सेल दीवार कैप्सूल के घटक जुड़े हैं, वे immunogenic है और एक ज्यादातर समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया9,10को बढ़ावा कर सकते हैं । इसके विपरीत, GXM और GalXM कैप्सूल के थोक बनाने के लिए (> 90% वजन से) और immunosuppressive प्रभाव है11. इसके इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव के अलावा, vivo में कैप्सूल की तेजी से वृद्धि मेजबान phagocytic कोशिकाओं (यानी, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज)12द्वारा घूस के लिए एक यांत्रिक बाधा पैदा करता है । सी. neoformans कैप्सूल और इसके संश्लेषण जटिल हैं, लेकिन कुल मिलाकर, वृद्धि हुई कैप्सूल व्यास वृद्धि हुई डाह6,13,14के साथ संबंधित है । इसे देखते हुए, यह C. neoformans शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है करने के लिए जल्दी और सही ढंग से कैप्सूल माप कर सकता है ।
C. neoformans सेल और इसके polysaccharide कैप्सूल गतिशील संरचनाओं और समय15के साथ परिवर्तन दिखा रहे हैं । कैप्सूल घनत्व, आकार, और विधानसभा में मेजबान पर्यावरण16,17,18में परिवर्तन के जवाब में बदल सकते हैं । कम लौह या पोषक तत्व का स्तर, सीरम के लिए जोखिम, मानव शारीरिक पीएच, और वृद्धि की सह2 कैप्सूल विकास शुरू करने के लिए जाना जाता है16,18,19,20. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने एक संक्रमण के दौरान immunoreactivity में महत्वपूर्ण मतभेदों में जिसके परिणामस्वरूप संरचनात्मक परिवर्तन दिखाया है, अपने मेजबान21,22से अधिक C. neoformans के लिए एक लाभ उधार । यह इसलिए जाना जाता है क्योंकि सी. neoformans कैप्सूल की वास्तुकला का कई तरह से विश्लेषण किया गया है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, उदाहरण के लिए, पता चला है कि कैप्सूल एक भीतरी इलेक्ट्रॉन के साथ एक विषम मैट्रिक्स है एक बाहरी, अधिक पारगंय परत23के नीचे घने परत. लाइट कैटरिंग और ऑप्टिकल चिमटी के उपयोग ने शोधकर्ताओं को इसके macromolecular गुण24को आगे स्पष्ट करने की अनुमति दी है । दोनों स्थिर और गतिशील प्रकाश बिखरने माप से परिणामों का विश्लेषण, हम जानते हैं कि polysaccharide कैप्सूल एक जटिल बंटी संरचना है23. ऑप्टिकल चिमटी संरचना की कठोरता का परीक्षण करने के साथ ही अपनी एंटीबॉडी जेट24का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, सी. neoformans कैप्सूल का अब तक का सबसे अक्सर कार्यरत विश्लेषण इसके आकार का माप है ।
कैप्सूल आकार के लिए, शोधकर्ताओं का उपयोग क्या एक सरल माप होना चाहिए: कैप्सूल के रैखिक व्यास. डिजिटल सूक्ष्मदर्शी एकाधिक सी. neoformans कोशिकाओं (आम तौर पर सैकड़ों) या तो भारत स्याही या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ दाग की छवियों पर कब्जा करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्येक कोशिका शरीर और आसपास के कैप्सूल का आकार मापा जाता है । डेटा संकलित कर रहे हैं, और कैप्सूल का औसत व्यास पूरे सेल व्यास (कोशिका शरीर + कैप्सूल) से कोशिका शरीर व्यास घटाकर द्वारा गणना की है. इस बिंदु तक, इन माप मैंयुअल रूप से किया गया है । जबकि आम तौर पर सटीक, इस विधि शोधकर्ताओं के लिए कमियां है । बड़े डेटा सेट दिन या सप्ताह भी हाथ से विश्लेषण करने के लिए ले जा सकते हैं । और क्योंकि इन माप मैंयुअल रूप से किया जाता है, मनोवाद और मानव त्रुटि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं ।
स्वचालित अभिकलनी छवि विश्लेषण आणविक कोशिका जीवविज्ञान के कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है, जैविक छवियों के तेजी से और अधिक विश्वसनीय विश्लेषण को सक्षम करने 25,26,27. सटीक छवि विश्लेषण तकनीक क्या अक्सर जटिल और विशाल डेटा सेट कर रहे है से मात्रात्मक जानकारी खदान के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, कुछ माप, विशेष रूप से C. neoformans कैप्सूल की माप, को स्वचालित करने के लिए कठिन हो गया है । सही ढंग से सेल दीवार और कैप्सूल है, जो आम तौर पर एक काले अंगूठी के रूप में प्रकट होता है जब चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि के बीच इंटरफेस की पहचान, एक साधारण सीमा का उपयोग कर हल करने के लिए परेशानी हो सकती है । इसके अलावा, संस्कृति में C. neoformans कोशिकाओं का झुरमुट एक साथ करते हैं और कोशिकाओं के सटीक विभाजन सटीक माप के लिए आवश्यक है ।
इस परियोजना का उद्देश्य था (i) C. neoformans में कैप्सूल प्रेरण के लिए मानक प्रोटोकॉल में से एक को दर्शाना, (ii) तुलना और कंट्रास्ट भारत स्याही और प्रतिदीप्ति धुंधला के रूप में वे कैप्सूल व्यास माप से संबंधित, (iii) सरल विकसित, गणना करने के तरीके कैप्सूल व्यास भारत स्याही की छवियों का उपयोग करने के लिए उपाय एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, और, (iv) कैप्सूल व्यास को मैन्युअल रूप से मापने और सॉफ्टवेयर स्वचालन का उपयोग करने के लाभों और सीमाओं का आकलन. हम पाते है कि दो धुंधला तरीके, सेल दीवार और कैप्सूल के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, जबकि अधिक समय लेने वाली, प्रयोगों के बीच सबसे सुसंगत परिणाम प्रदान की है । हालांकि, दोनों तरीकों हमें सफलतापूर्वक अलग कैप्सूल आकार का प्रदर्शन लैब और नैदानिक सी. neoformans उपभेदों के बीच भेद करने के लिए सक्षम होना चाहिए । इसके अलावा, हम भारत स्याही सना हुआ छवियों से कैप्सूल व्यास के माप को स्वचालित करने में सक्षम थे और पाया कि इस कैप्सूल के मैनुअल माप के लिए एक व्यवहार्य विकल्प था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
दशकों के लिए, कैप्सूल दोनों mycologists और चिकित्सकों में रुचि के लिए अनुसंधान का एक बड़ा ध्यान केंद्रित किया गया है C. neoformans और रोगज़नक़ के लिए एक प्रमुख डाह कारक के रूप में अपनी भूमिका के कारण cryptococcosis । उपभेदों …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आणविक जैव विज्ञान (MOBI) डॉक्टरेट कार्यक्रम और मध्य टेनेसी राज्य विश्वविद्यालय (MTSU) में जीवविज्ञान विभाग इस अध्ययन के लिए धन प्रदान करने के लिए धंयवाद । परियोजना भी एक विशेष परियोजनाओं MTSU फाउंडेशन द्वारा D.E.N. को संमानित अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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