נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay
Summary
מאמר זה מציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- hemangioblastomas (HBs) ותפקידו HBs. התוצאות להאיר את המורכבות של HB-כורוידאלית, מציע כי זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה הוא רק מנגנון משלים ב- HB-כורוידאלית.
Abstract
איון של הגן מדכא הגידול פון היפל-Lindau. אייצ ‘ (.-אל) ממלא תפקיד מכריע בהתפתחות של hemangioblastomas (HBs) בתוך מערכת העצבים המרכזית אנושי (CNS). עם זאת, התהליך האבולוציוני של HBs (כולל כורוידאלית) והן המקור cytological נותרו שנויים במחלוקת, אנגיוגנזה עבור אייצ ‘-אל-HBs, בהתבסס על קלאסי על בסיס חצי פנסיון אנגיוגנזה, יצרו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים. מכשול רציני תרגום קליני מוצלח של טיפול אנטי-כלי הדם היא חוסר הבנה מעמיקה של כורוידאלית זה הגידול בכלי הדם. במאמר זה, נציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs. באמצעות הליך זה, חוקרים יכולים במדויק להבין את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון ולזהות את הפונקציה של זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה HBs. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את הטיפול האנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר עבור גידולים, אשר יש פוטנציאל גבוה translational לטיפול גידולים או לסיוע באופטימיזציה של הטיפול האנגיוגנזה anti HBs בעתיד תרגומים. התוצאות להאיר את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון, מציע כי אנגיוגנזה טופס הנפוץ הזה הוא רק מנגנון משלים בכורוידאלית על בסיס חצי פנסיון.
Introduction
Hemangioblastomas (HBs) הם גידולים שפירים כלי הדם אשר נמצאים אך ורק בתוך האדם מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם מפתחים אצל חולים עם מחלת פון היפל-לינדאו (אייצ ‘-אל) או נגעים סדיר. אייצ ‘-אל-HBs קשה לרפא באמצעות טיפול כירורגי עקב הישנות תכופים, נגעים מרובים לנבוע זה גנטי ההפרעה1. למרות איון של הגן מדכא הגידול אייצ ‘-אל נחשב שורש tumorigenesis של אייצ ‘-אל-HBs, המקור cytological (כולל כורוידאלית) ואת התהליך האבולוציוני של HBs נותרו במחלוקת במידה רבה2. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים הביולוגיים HB-neovascular עשוי לספק תובנות שימושיות האסטרטגיות אנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר אייצ ‘-אל-HBs.
מחקרים אחרונים הראו כי על בסיס חצי פנסיון-כורוידאלית דומה4,3,embryologic vasculogenesis5. קלאסי כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF)-אנגיוגנזה בתיווך כי מקורם אנדותל כלי הדם, אשר מונעת על ידי אייצ ‘-אל אובדן התפקוד, גרמו התפשטות והזמנו neovascular היווצרות, אשר כבר6. בשנת 1965, Cancilla וצימרמן מצא, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כי HBs מקורם אנדותל7. מאוחר יותר התברר כי תאי סטרומה נגזרים מתוך רכיב vasoformative8. בשנת 1982, Jurco. et al. נמצא כי תאי סטרומה הם מקור אנדותל9. לכן, שיערנו כי תאי אנדותל כלי הדם אדם הם התאים המקוריים של HB-כורוידאלית10. אמנם עדיף להשתמש התרבויות העיקרי מתאי HB נגזר אייצ ‘-אל המטופל ניתוחים, מחקרים קודמים שלנו ציינו כי תרבויות העיקרי של HB אינם יציבים, שורות תאים לא יכול להיות הוקמה3. יתר על כן, תרבויות ראשי בסביבת 3D לא יוכל לזהות המקור cytological של HB-כורוידאלית כי הם כוללים המוצא לאגס התרבותי מרכיבים על בסיס חצי פנסיון-וסקולרית10,11. לכן, כמודל פרימיטיביים וקלאסי של תאי אנדותל, תאי אנדותל כלי הדם (HUVEC) אדם יכול לשמש מודל הסלולר אלטרנטיבי HBs.
וזמינותו נבטי ספרואיד הוא מודל חדש12,הנדסת רקמות,13. בנייר זה, יישום תלת-ממד coculture מבוססי קולגן מערכת במבחנה באמצעות ספרואיד את לבלוב assay פותחה, עם מטרה הכוללת כדי להעריך אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאחרונה, מספר תחומי מחקר לביולוגיה היו מגורה על ידי המחקר של אנדותל האנגיוגנזה15. במאמר זה, פיתחנו ספרואיד אנדותל של לבלוב טכניקה כמודל ניסויי ללמוד היווצרות כלי שמקורו ג’ין אייצ ‘-אל אובדן התפקוד בתאי האנדותל מניפולציות כדי לזהות מולקולות המועמד הרומן של אשד אנגיוגנזה. למיטב ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שנגחאי ועדת המדע והטכנולוגיה (15411951800, 15410723200). המחברים רוצים להודות פרופסור של YuMei וון וז’או צ’או פרופסור באוניברסיטת פתוגניים מיקרואורגניזם המחלקה של פודאן לסיוע טכני שלהם.
Materials
| human umbilical vein endothelial cell | Fudan IBS Cell Center | FDCC-HXN180 | |
| dulbecco’s modified eagle’s medium | Gibco | 11995040 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 26400044 | |
| PLKO.1-puro vector | Addgene | #8453 | |
| packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D round-bottom 96-well plates | S-Bio | MS-9096M | |
| matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-070 | reduced serum medium |
| 15-well plate | Ibidi | 81501 | Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight |
| endothelial cell growth supplements | Sciencell | #1052 | |
| 10-cm culture dish | Corning | Scipu000813 | |
| Puromycin | Gibco | A1113802 | |
| typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Automated Cell Counter System | BioTech | ||
| Image Analysis software | Winmasis | http://mywim.wimasis.com |
References
- Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
- Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist’s viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
- Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
- Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102 (2014).
- Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
- Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
- Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
- Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
- Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
- Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
- Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
- Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
- Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
- Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- D’Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).
- Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).
- Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
- Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
- Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
- Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
- Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
