מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing
Summary
כאן, אנו מדווחים על כסף ופשוט נמוכים מכתים פרוטוקול אשר דורש רק שלושה ריאגנטים, 7 דקות של עיבוד, מתאימה לדור מהירה של נתונים איכותיים הסובייטית בניתוח גנטי.
Abstract
חזור על הרצף פשוטה (הסובייטית) הוא אחד הסמנים היעיל ביותר בשימוש מחקר גנטי החי והצומח ותוכניות השבחה מולקולרית. צביעת כסף היא שיטה בשימוש נרחב עבור זיהוי סמני הסובייטית לזיהוי ג’ל. עם זאת, פרוטוקולים קונבנציונליים עבור צביעת כסף הם טכנית תובעניים ולגזול. כמו רבים אחרים מעבדה ביולוגית טכניקות, כסף מכתים פרוטוקולים מוטבו בהתמדה לשיפור יעילות הזיהוי. כאן, אנו מדווחים כסף פשוטה מכתים שיטת מפחית עלויות ריאגנט ומגבירה באופן משמעותי את הבהירות ברזולוציה ותמונה של זיהוי. השיטה החדשה דורש שני שלבים עיקריים (הספגה ופיתוח) שלושה ריאגנטים (חנקת הכסף נתרן הידרוקסידי, פורמלדהיד), ואת רק 7 דקות של עיבוד עבור ג’ל לזיהוי שאינם denaturing. לעומת פרוטוקולים שדווחה בעבר, שיטה חדשה תהיה קלה יותר, מהר יותר ומשתמש ריאקטיבים כימיים פחות לגילוי הסובייטית. לכן, זה כסף פשוטה, בעלות נמוכה ויעיל מכתים פרוטוקול ייהנו מיפוי גנטי והשבחה בסיוע סמן על ידי דור מהירה של נתונים סמן הסובייטית.
Introduction
הפיתוח של סמנים מבוססי ה-PCR יש מהפכה המדע של הצמח גנטיקה, רבייה1. סמנים (הסובייטית) אני חוזר פשוט רצף הם בין סמני DNA הנפוצות ביותר ואת הרב-גוניים ביותר. כיסוי רחב הגנום שלהם, לשפע, ירידה לפרטים הגנום, הדיר הם חלק היתרונות של סמנים הסובייטית בנוסף ירושה codominant שלהם עבור זיהוי אחרים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים2. מספר מחקרים השתמשו הסובייטית סמנים כדי לחקור מגוון גנטי, לעקוב אחר שושלת, לבנות תאחיזה מפות, מיפוי גנים עבור תכונות כלכלית3,4.
מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית בדרך כלל מופרדים באמצעות agarose או לזיהוי ג’ל אלקטרופורזה ולאחר מכן דמיינו עם צביעת כסף או תחת אור UV לאחר צביעת עם אתידיום ברומיד. צביעת כסף שברי DNA ב לזיהוי ג’לים רגיש יותר אחרים מכתימים שיטות5,6 , כבר בשימוש נרחב לאיתור שברי DNA כגון סמני הסובייטית7.
כמו רבים וטכניקות מעבדה ביולוגית, צביעת כסף של ג’ל לזיהוי בהתמדה השתפר מאז שלה קודם להיות כפי שדווח טכניקה ויזואליזציה שבר ב- 1979-8. השיטה שונתה בתחילה לזיהוי שברי DNA מאת בסאם. et al. 6 ב-1991, אז משופרת על ידי סאנגינטי ועמיתיו9 בשנת 1994. השיטה מוטבה עוד יותר האחרון כמה עשורים6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. עם זאת, רוב אלה הגירסאות המעודכנות של הפרוטוקולים עדיין יש מספר חסרונות כגון דרישה טכנית גבוהה, זמן עיבוד זמן קיבעון והרכבה6, המגבילות את היישום של פרוטוקולים אלה7, 11. פרוטוקול אופטימלית המשלב נמוכים עם יעילות גבוהה של זיהוי מקטע ה-DNA הוא צורך דחוף עבור יישום שגרתי של כסף מכתים במחקר הביולוגי.
בנוסף, ניתן לחלק לזיהוי ג’ל ג’ל לזיהוי denaturing ו- denaturing, שניהם יכול לשמש עבור זיהוי סמנים הסובייטית באמצעות הכסף מכתים בשיטה. אפקט והרזולוציה של אשר לא משמעותית שונות, אך ללא denaturing לזיהוי ג’לים להקל על תהליך לקחת פחות זמן16.
הקודמת מחקר15, מטרת המחקר הנוכחי הוא הוא לתיאור של כסף ממוטבת מכתים פרוטוקול בפירוט לגילוי מהיר, קל וזה נמוכים של סמני הסובייטית ג’ל לזיהוי שאינם denaturing.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכביסה של ג’ל לאחר העיבור הוא שלב קריטי. זמן הכביסה לא מספיק וכרך מים עשוי לגרום להסרת לא שלם של הספגה פתרון על פני השטח של הלוח ואת הג’ל, לגרום רקע כהה. הזמן המתאים לפתח עוד צעד מפתח, פיתוח יתר עלולה לגרום רקע בצבע חום כהה עם ניגודיות נמוכה התמונה שברי DNA. בנוסף, הצעד הספגה באופן משמעותי משפיע ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי את גואנגדונג מדעי הטבע קרן של סין (2015A030313500), המחוז הבינלאומי המפתח פלטפורמה שיתופית המחקר המדעי המחקר פרוייקט של גואנג-דונג ההשכלה הגבוהה (2015KGJHZ015), המדע, תכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג הניהול של מונופול טבק (201403, 201705), מדע, טכנולוגיה תוכנית של גואנג-דונג בסין (2016B020201001), הפרויקט הכשרה חדשנות לאומי עבור סטודנטים לתואר ראשון (201711078001). איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
References
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
