Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação
Summary
Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.
Abstract
Repita sequência simples (SSR) é um dos marcadores mais eficazes utilizados na pesquisa genética vegetal e animal e programas de reprodução molecular. Coloração de prata é um método amplamente usado para a detecção de marcadores SSR em gel de poliacrilamida. No entanto, os protocolos convencionais para coloração de prata são tecnicamente exigente e demorado. Como muitos outro laboratório biológico técnicas, prata, protocolos de coloração foram constantemente otimizadas para melhorar a eficiência da deteção. Aqui, nós relatamos um método que reduz custos de reagente e aprimora a clareza de resolução e imagens de deteção de coloração de prata simplificada. O novo método requer duas etapas principais (impregnação e desenvolvimento) e três reagentes (formol, hidróxido de sódio e nitrato de prata) e apenas 7 minutos de processamento para um gel de poliacrilamida não-desnaturação. Comparado com protocolos relatados anteriormente, este novo método é mais fácil, mais rápido e usa menos reagentes químicos para a deteção de SSR. Portanto, esta prata simples, barata e eficaz que mancha o protocolo beneficiará mapeamento genético e reprodução assistida por marcador, por uma geração rápida de dados marcador SSR.
Introduction
O desenvolvimento de marcadores baseados em PCR revolucionou a ciência da genética vegetal e de reprodução1. Sequência simples repetição (SSR) marcadores são entre os marcadores de DNA mais usados e mais versátil. Sua cobertura ampla do genoma, abundância, especificidade do genoma e repetibilidade são alguns dos méritos de marcadores SSR, além de sua herança codominant para a detecção de genótipos homozigóticos2. Vários estudos utilizaram marcadores SSR para investigar a diversidade genética, rastrear ascendência, construir mapas genéticos de ligação e mapear os genes para características economicamente importantes,3,4.
Produtos PCR dos marcadores SSR comumente são separados usando electroforese de agarose ou gel de poliacrilamida e depois visualizadas com coloração de prata ou sob luz UV, após coloração com brometo de etídio. Coloração prata de fragmentos de DNA em gel de poliacrilamida é mais sensível do que a outra coloração métodos5,6 e tem sido amplamente utilizada para detectar os fragmentos do ADN como marcadores SSR7.
Como muitas técnicas de laboratório biológico, prata coloração dos géis de poliacrilamida constantemente melhorou desde o seu primeiro sendo relatado como uma técnica de visualização do fragmento em 19798. A técnica foi modificada inicialmente para a deteção de fragmentos de DNA por Bassam et al 6 em 1991 e depois aperfeiçoado por Sanguinetti e colegas de trabalho9 em 1994. O método foi otimizado ainda mais no passado poucas décadas6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. no entanto, a maioria dessas versões atualizadas dos protocolos ainda tem alguns inconvenientes como alta demanda técnica e longo tempo para fixação de processamento e montagem de6, que limitam a aplicação destes protocolos7, 11. Um protocolo ideal que combina baixo custo com alta eficácia da detecção de fragmento de DNA é urgentemente necessária para aplicação rotineira de prata coloração em pesquisas biológicas.
Além disso, gel de poliacrilamida podem ser dividido em gel de poliacrilamida desnaturação e não-desnaturação, e ambos podem ser usados para a detecção de marcadores SSR, usando o método de coloração de prata. O efeito e a resolução dos quais não diferem significativamente, mas não-desnaturação géis de poliacrilamida são mais fáceis de processo e tomar menos tempo16.
Com base na pesquisa anterior15, do atual estudo tem como objetivo descrever uma otimizado prata que mancha o protocolo em detalhe para a deteção rápida, fácil e baixo custo de marcadores SSR em gel de poliacrilamida não-desnaturação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A lavagem do gel após a impregnação é uma etapa crítica. Volume de tempo e água de lavagem insuficiente pode causar a remoção incompleta de solução de impregnação na superfície da placa e o gel e resultar em um fundo escuro. O tempo de desenvolvimento adequado é mais um passo chave, desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Além disso, a etapa de impregnação afeta significativamente coloração eficiência de fragmentos de DNA. A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação de ciências naturais de Guangdong de China (2015A030313500), a plataforma pesquisa cooperativa internacional chave Provincial e o Major científico pesquisa projeto de Guangdong ensino superior (2015KGJHZ015), a ciência e Plano de tecnologia da administração de monopólio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), a ciência e a tecnologia plano de Guangdong de China (2016B020201001), o projecto de formação nacional de inovação para alunos de graduação (201711078001). Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e o empregador.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
References
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