Summary

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Published: May 19, 2018
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Summary

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Abstract

Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.

Introduction

Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher1gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen2beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt3. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes4. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL5verwendet werden können.

Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.

Protocol

(1) Kultur der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen Beschichtung von rekombinanten menschlichen E-Cadherin Fc Fusionsprotein (E-Cad-Fc) oder andere Matrizen für hPSC Kultur geeignet 6 Verdünnen Sie E-Cad-Fc mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung enthält Calcium und Magnesium (DPBS (+)) bis 15 μg/mL. Mantel 100 mm Federweg Gewebekultur Gerichte mit 5 mL der verdünnten E-Cad-Fc und Inkubation bei 37 ° c für mindestens 1 h …

Representative Results

Generation von Hepatozyten – wie Zellen: Abbildung 1 beschreibt den Zeitrahmen der Änderungen, die während der Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auftreten. Die Kultur der iPSCs auf E-Cad-Fc bietet ca. 2 mm Durchmesser-Kolonien, die den pluripotenten Marker OCT4 Ausdrücken (Abbildung 1A-B). Die Morphologie der Zellen auf eine E…

Discussion

Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame1gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelfors…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 und HG006398, S.A.D) unterstützt. Wir möchte Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop und Ran Jing für ihre Beiträge danken.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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