Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica
Summary
Descrevemos a fixação, incorporação de parafina e técnicas de corte finas para biofilmes microbianos de colônia. Em amostras preparadas, padrões de expressão de subestrutura e repórter de biofilme podem ser visualizados por microscopia.
Abstract
Corte através de incorporação de parafina é uma técnica amplamente estabelecida em sistemas eukaryotic. Aqui nós fornecemos um método para a fixação, incorporação e corte de biofilmes intactos colônia microbiana usando cera de parafina perfundida. Para adaptar esse método para uso em biofilmes de colônia, desenvolveu técnicas para a manutenção de cada amostra no seu substrato de crescimento e estratificação-lo com uma sobrecamada de agar e adicionado lisina para a solução de fixador. Essas otimizações melhoram a retenção de amostra e preservação de recursos recorrendo. Amostras preparadas desta maneira são passíveis de fino seccionamento e por microscopia de luz, fluorescência e transmissão de imagem. Nós aplicamos esta técnica a colônia de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. O elevado nível de detalhe visível nas amostras geradas por esse método, combinado com a estirpe de repórter engenharia ou a utilização de corantes específicos, pode fornecer insights emocionantes sobre a fisiologia e o desenvolvimento de comunidades microbianas.
Introduction
A maioria dos micróbios têm a capacidade de forma de biofilmes, comunidades de células realizaram em conjunto pelas matrizes de produção própria. Biofilmes podem ser cultivadas em muitos tipos de configurações físicas, com diferentes regimes de fornecimento de nutrientes e substrato. Ensaios específicos para a formação de biofilme tendem a produzir estruturas multicelulares reprodutíveis e arquiteturas comuns são observadas para espécies filogeneticamente diversos no nível macroscópico ou comunidade. Quando os micróbios são crescidos como colônias em meio sólido sob uma atmosfera, morfologia macroscópica transmite informações sobre a capacidade de produção de matriz e muitas vezes se correlaciona com outros traços 1,2,3. A arquitetura interna das colónias microbianas também pode fornecer pistas sobre biofilme específico química e fisiologia, mas tem sido difícil de caracterizar. Recentes aplicações de técnicas de cryoembedding e cryosectioning de colônias bacterianas permitiram imaging e visualização de características específicas na resolução sem precedentes 4,5,6. No entanto, estudos com tecido animal mostraram que parafina incorporação fornece superior preservação da morfologia quando comparado com o cryoembedding 7 e tem sido usado para visualizar as bactérias em tecidos 8,9. Portanto, nós desenvolvemos um protocolo para fixação, incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos de colônia. Aqui, iremos descrever a preparação de Pseudomonas aeruginosa PA14 colônia-biofilme seções finas 10,11, mas temos aplicado também com sucesso esta técnica de biofilmes formados pelas bactérias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae12.
O processo de incorporação de parafina e fino-corte biofilmes segue uma lógica simples. Primeiro, os biofilmes são encerradas em uma camada de ágar para preservar a morfologia durante o processamento. Em segundo lugar, os biofilmes envolto estão submersas no fixador a macromoléculas crosslink e preservar a micromorfologia. Estes são então desidratados com álcool, limpo com um solvente apolar mais e em seguida infiltradas com cera de parafina líquida. Uma vez que se infiltrou, as amostras são incorporadas em blocos de cera para corte. Seções são cortadas, montadas em lâminas e depois reidratadas para devolvê-los para um estado mais nativo. A partir deste ponto, podem ser manchadas ou cobertos de meio de montagem para análise microscópica.
Este protocolo produz seções finas de biofilmes microbianos apropriados para análise histológica. Subestruturas de biofilme colônia são visíveis quando seções finas preparadas usando este método são imaginadas por microscopia de luz. Biofilmes também podem ser cultivadas em manchas de fluorescente contendo mídia específica para recursos individuais ou manchados na etapa de reidratação, imediatamente antes da montagem (etapas 9.5-9,6). Finalmente, os micróbios podem ser projetados para produzir proteínas fluorescentes de maneira constitutiva ou regulamentado permitindo em situ relatórios de célula distribuição ou gene expressão dentro dessas comunidades. Usamos esses métodos para determinar a profundidade de biofilme de colônia, distribuição de célula, distribuição da matriz, os padrões de crescimento e expressão gênica spatiotemporal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amostras de tecido parafina-incorporação e fino-corte é uma técnica histológica clássica que permite imagens de estruturas morfológicas-micro e é comumente usada em tecidos de eucariotas e aplicou-se com algum sucesso para amostras microbianas8 ,9. Enquanto cryoembedding permite forte retenção de sinal endógeno e imunofluorescência, incorporação de parafina é geralmente é preferível, pois proporciona melhor preservação da morfologia<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela NSF carreira prêmio 1553023 e prêmio NIH/NIAID R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
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