Paraffin inbäddning och tunn snittning av mikrobiell kolonin biofilmer för Mikroskopisk analys
Summary
Vi beskriver fixering, paraffin inbäddning och tunn snittningen tekniker för mikrobiell kolonin biofilmer. I beredda prover, kan biofilm underkonstruktion och reporter uttrycksmönster visualiseras genom mikroskopi.
Abstract
Snittning via paraffin inbäddning är en allmänt etablerad teknik i eukaryota system. Här tillhandahåller vi en metod för fixering, inbäddning, och snittning av intakt mikrobiell kolonin biofilmer med perfunderade paraffinvax. Anpassa denna metod för användning på kolonin biofilmer, vi utvecklat tekniker för att behålla varje prov på dess tillväxt substrat och laminering det med en agar overlayer och lagt till lysin till fixativ lösningen. Dessa optimeringar förbättra prov lagring och konservering av micromorphological funktioner. Prover beredd på detta sätt är mottagliga för tunn snittning och imaging med ljus, fluorescens och överföring elektronmikroskopi. Vi har tillämpat denna teknik till kolonin biofilmer av Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisoch Vibriocholerae. Den höga detaljnivån som syns i prover som genereras av denna metod, kombinerat med reporter stam konstruktion eller användning av vissa färgämnen, kan ge spännande insikter i fysiologi och utvecklingen av mikrobiella samhällen.
Introduction
De flesta mikrober har kapacitet att bilda biofilmer, hålls samhällen av cellerna samman av egenproducerade matriser. Biofilmer kan odlas i många typer av fysiska uppställningar, med olika regimer av näringsämnen och substrat bestämmelse. Specifika analyser för biofilm bildning tenderar att ge reproducerbara flercelliga strukturer, och vanliga arkitekturer observeras för fylogenetiskt olika arter till gemenskapen eller makroskopisk nivå. När mikrober odlas som kolonier på fast substrat under en atmosfär, makroskopisk morfologi förmedlar information om kapaciteten för matrix produktion och ofta korrelerar med andra drag 1,2,3. Den inre arkitekturen av mikrobiell kolonier kan också ge ledtrådar om biofilm-specifika kemi och fysiologi, men har varit svårt att karakterisera. Senaste program cryoembedding och kryosnitt tekniker till bakteriekolonier har aktiverat bildbehandling och visualisering av specifika funktioner på oöverträffad upplösning 4,5,6. Studier med animalisk vävnad har dock visat att paraffin inbäddning ger överlägsen bevarandet av morfologi jämfört med cryoembedding 7 och har använts för att visualisera bakterier i vävnaderna 8,9. Därför har vi utvecklat ett protokoll för fixering, paraffin inbäddning och tunn snittning av mikrobiell kolonin biofilmer. Här kommer vi att beskriva utarbetandet av Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biofilm tunnslip 10,11, men vi har också framgångsrikt tillämpat denna teknik till biofilmer som bildas av bakterierna Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, och Vibriocholerae12.
Processen för paraffin-inbäddning och tunn-snittning biofilmer följer en enkel logik. Först, biofilmer är inneslutna i ett lager av agar att bevara morfologi under bearbetning. För det andra de inneslutna-biofilmer är nedsänkt i ett fixativ till crosslink makromolekyler och bevara micromorphology. Dessa är sedan uttorkad med alkohol, rensat med ett mer icke-polära lösningsmedel och sedan infiltrerade med flytande paraffin vax. När infiltrerat, är proverna inbäddade i vax block för snittning. Avsnitt är skär, monterad på bilderna och sedan uppblött för att återlämna dem till en mer ursprunglig stat. Från denna punkt, kan de färgas eller täckt av monteringsmedium för Mikroskopisk analys.
Detta protokoll producerar tunnslip av mikrobiell biofilmer lämplig för histologisk analys. Kolonin biofilm på nationell nivå är synliga när tunnslip tillagas med denna metod är fotograferad av ljusmikroskop. Biofilmer kan också odlas på media innehållande fluorescerande fläckar som är specifika för enskilda funktioner eller målat på steget rehydrering, omedelbart före montering (steg 9,5-9,6). Slutligen, mikrober kan vara konstruerad för att producera fluorescerande proteiner i en konstitutiv eller reglerade mode möjliggör i situ rapportering av cell distribution eller gen uttryck inom dessa samhällen. Vi har använt dessa metoder för att bestämma kolonin biofilm djup, cell distribution, matrix distribution, växtmönster och spatiotemporal genuttryck.
Protocol
Representative Results
Discussion
Paraffin-inbäddning och tunn-snittning av vävnadsprover är en klassisk histologiska teknik som möjliggör avbildning av mikro-morfologiska strukturer och används ofta på eukaryota vävnader har tillämpats med framgång på mikrobiell prover8 ,9. Medan cryoembedding möjliggör en stark retention av endogena och Immunofluorescerande signal, är paraffin inbäddning generellt att föredra eftersom det ger bättre bevarande av morfologi16</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NSF karriär AWARD 1553023 och NIH/NIAID award R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
