Isolering af bughinden-afledte mastceller og deres funktionelle karakterisering med Ca2 +-billedbehandling og degranulering Assays
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at isolere og dyrke murine peritoneal mastceller. Vi også beskriver to protokoller for deres funktionelle karakterisering: en fluorescerende billeddannelse af intracellulære gratis Ca2 + koncentration og en degranulering analysen baseret på kolorimetriske kvantificering af de frigivne β-hexosaminidase.
Abstract
Mast celler (MCs), spiller som en del af immunsystemet, en afgørende rolle i forsvaret vært mod flere patogener og i indledningen af den allergiske immunrespons. Aktivering af MCs via cross-linking for overflade IgE bundet til høj affinitet IgE receptor (FcεRI), samt gennem stimulering af flere andre receptorer, initierer stigningen i de gratis intracellulære Ca2 + niveau ([Ca2 +]jeg) der fremmer frigivelse af allergiske og inflammatoriske mediatorer. Identifikation af molekylære vælgere involveret i disse signaling veje er afgørende for at forstå reguleringen af MC funktion. I denne artikel vil beskrive vi en protokol til isolering af murine bindevæv type MCs ved peritoneal lavage og dyrkning af peritoneal MCs (PMCs). Kulturer af MCs fra forskellige knockout musemodeller af denne metode repræsenterer en nyttig metode til identifikation af proteiner involveret i MC signalering veje. Derudover vi også beskrive en protokol for enkelt celle Fura-2 imaging som en vigtig teknik til kvantificering af Ca2 + signalering i MCs. fluorescens-baseret overvågning af [Ca2 +]jeg er en pålidelig og almindeligt anvendte tilgang til studere Ca2 + signalering begivenheder, herunder butik-drevet calcium indrejse, der er af allerstørste betydning for MC aktivering. For analyse af MC degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release assay. Mængden af β-hexosaminidase udgivet i dyrkningsmediet betragtes som en degranulering markør for alle tre forskellige sekretoriske delmængder beskrevet i MCs. β-hexosaminidase kan nemt kvantificeres ved dets reaktion med en colorigenic substrat i en mikrotiter plade kolorimetriske assay. Denne meget reproducerbare teknik er omkostningseffektiv og kræver ingen specialiseret udstyr. Alt i alt den angivne protokol viser et højt udbytte af MCs udtrykker typisk MC overflade markører, viser typiske morfologiske og fænotypiske træk ved MCs, og demonstrere meget reproducerbare svar til secretagogues i Ca2 +– billedbehandling og degranulering assays.
Introduction
MCs spiller en fremtrædende rolle i medfødte og erhvervede immunrespons. Specifikt, MCs deltage i aflivning af patogener, som bakterier og parasitter, og også forringe potentielt giftige endogene peptider eller komponenter af venoms (for anmeldelse Se Galli et al. 20081). Den fysiologiske rolle af MCs i medfødte og adaptive immunitet er genstand for heftig debat. Derfor kræver de mange data uoverensstemmelser i undersøgelser udført med forskellige MC-mangelfuld musemodeller en systematisk revurdering af immunologiske funktioner af MCs ud over allergi2. Modne MCs er for det meste lokaliseret i væv og organer som hud, lunge og tarmen, og findes normalt kun i små mængder i blodet. MCs skyldes hæmatopoietisk prækursorer, som MC progenitorceller, og fuldføre deres differentiering og modning i microenvironments af næsten alle vaskulariserede væv1. T-celle-afledte faktor interleukin (IL) -3 fremmer selektivt levedygtighed, spredning og differentiering af musen MCs pluripotente indbyggere fra deres hæmatopoietisk stamfaderen3. Stem cell faktor (SCF) er produceret af strukturelle celler i væv og spiller en afgørende rolle i MC-udvikling, overlevelse, migration, og funktionen4. Egenskaberne for individuelle MCs kan variere afhængigt af deres evne til at syntetisere og gemme forskellige proteaser eller proteoglycaner. I mus, de såkaldte bindevæv-type MCs adskiller sig fra slimhinden MCs efter deres anatomiske lokalisering, morfologi og indhold af heparin og proteaser5.
I MCs, en stigning på gratis cytosole Ca2 + ([Ca2 +]jeg) er uundværlig for degranulering og produktion af eicosanoider, samt for syntesen af cytokiner og aktivering af transkriptionsfaktorer svar på antigen og forskellige secretagogues6. En større downstream mål for disse stimuli er fosfolipase C, som hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverer protein kinase C og IP3 frigiver ioner af Ca2 + fra det endoplasmatiske reticulum. Nedbrydning af disse butikker aktiveres Ca2 + tilstrømning gennem plasmamembran Ca2 + kanaler, fører til at lagre drives calcium post (SOCE). Denne proces er fremkaldt gennem samspillet af Ca2 +-sensor, stromale interaktion molekyle-1 (Stim1), i det endoplasmatiske reticulum med Orai17 samt gennem aktivering af forbigående receptor potentielle kanoniske (TRPC) kanal proteiner (til gennemgang Se Freichel et al. 20148) i plasma membranen.
For at studere anvendes den fysiologiske rolle af disse kanaler, flere farmakologiske (anvendelse af kanal blokkere) eller genetiske metoder typisk. I sidstnævnte tilfælde undertrykkelse af protein udtryk er opnået ved at målrette mRNA (knockdown) eller genomisk DNA redigering med globale eller væv-specifikke9 sletning af en exon kodning en pore danner underenhed af en kanal (knockout). En blokering med tilstrækkelig specificitet for disse kanaler er begrænset. Desuden, det knockdown tilgang kræver omhyggelig kontrol af dens effektivisering bruger, fx., vestlige duppes analyse, og hæmmes af utilgængelighed af specifikke antistoffer for målrettede kanal protein i mange tilfælde. Brugen af knockout musemodeller er således stadig betragtes som guldstandarden for en sådan analyse. Foretrukne i vitro model for undersøgelsen af MC funktioner er dyrkning af PMCs, der kan være isolerede ex vivo som en fuldt moden befolkning (i modsætning til skelne MCs i vitro fra, fx., knoglemarv celler)10 . I forhold til knoglemarven afledt MCs (BMMCs), som er også almindeligt anvendt til at studere MC funktion i vitro, stimulation af FcεRI og beta-hexosaminidase er udgivelse øget 8-fold og 100 i PMCs, henholdsvis. I denne artikel vil beskrive vi en metode til isolering og dyrkning af murine PMCs, som giver mulighed for at få efter 2 uger af dyrkning af et stort antal af ren bindevæv Skriv MCs, tilstrækkelige til yderligere analyse.
Trods de seneste fremskridt i udviklingen og anvendelsen af genetisk kodet calcium indikatorer, er deres forbrug stadig begrænset af vanskeligheder i levering af gener til target-cellerne, specifikt i højt specialiserede celler som primære kulturperler MCs. Desuden, mangler denne gruppe af fluorescerende indikatorer for [Ca2 +]jeg målinger stadig ratiometric farvestoffer med et højt dynamikområde. Af disse grunde er den foretrukne metode til måling af ratiometric [Ca2 +]jeg stadig brugen af de fluorescerende farvestof “Fura-2”11.
I øjeblikket mest anvendte almindeligt metode til evaluering af MC aktivering og degranulering er måling af β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk mægler, er en af komponenterne MC granula, der er co-løst med histamin i konstant andel fra MCs12. Β-hexosaminidase kan let og præcist målt gennem dets reaktion med et specifikt substrat, som producerer en målelig mængde af et colorigenic produkt, der let kan påvises i en mikrotiterplade kolorimetriske assay. I denne artikel rapporteres en anvendelse af denne teknik til analyse af PMCs degranulering som svar på en lang række stimuli.
Sammenlægning af høj-affinitet plasmalemmal IgE receptor (FcɛRI) aktiveres i MCs en alsidig intracellulære signalvejen, fører til en frigivelse af sekretoriske granulet indhold i det omgivende ekstracellulære rum. Ud over den specifikke antigen, mange andre stimuli kan aktivere MCs for at frigive en alsidig vifte af immunmodulerende mæglere, som supplerer anaphylatoxins (fx., C3a og C5a)13, vasokonstriktor peptid endothelin 1 (ET1)14 , som godt som mange kationiske stoffer og stoffer provokere pseudoallergic reaktioner (fx., icatibant)15 ved binding til MRGPRX216. Intracellulær signalering veje involveret i MRGPR-induceret MCs degranulering karakteriseres dårligt i forhold til FcɛRI-medieret intracellulær signalering; disse veje kun begyndte at blive intensivt undersøgt i løbet af de sidste par år17 efter receptor identifikation16. I vid udstrækning, fortsat plasma membran Ionkanaler involveret i calcium post efterfulgt af MRGPRX2 stimulation skal forstås. Derfor, denne artikel fokuserer også på intracellulære calcium signalering og degranulering af MCs stimuleret med MRGPR agonister.
Protocol
Representative Results
Discussion
MC modeller kan med held anvendes til at studere MC degranulering, chemotaxis, vedhæftning samt belyse intracellulær signalering transduktion veje involveret i MC aktivering. Nogle forskere brug menneskelige MCs modeller, som udødeliggjort linjer (LAD2 og HMC1) eller menneskelige MCs afledt af ledning blod stamceller (CD133 +) og perifert blod stamceller (CD34 +). Andre foretrækker gnaver MC modeller, såsom udødeliggjort (rotte baserig leukæmi RBL – 2H 3 MC linje) eller primære kulturperler (mus knogle-marv-afled…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Julia Geminn for teknisk bistand i masten celle forberedelse og dyrkning. Dette arbejde blev støttet af det transregionale Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
