Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.
Abstract
Mastocytes (STM), dans le cadre du système immunitaire, joue un rôle clé dans la défense de l’hôte contre plusieurs agents pathogènes et à l’initiation de la réponse immuno-allergique. L’activation de la PSC via la mise en réseau de surface IgE lié au récepteur de haute affinité IgE (FcεRI), ainsi que par le biais de la stimulation de plusieurs autres récepteurs, initie la montée de la libre niveau2 + Ca intracellulaire ([Ca2 +]i) qui favorise la libération de médiateurs inflammatoires et allergiques. L’identification des constituants moléculaires impliquées dans ces voies de signalisation est cruciale pour comprendre la régulation de la fonction de MC. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement du type murin du tissu conjonctif MCs par lavage péritonéal et culture du MCs péritonéales (PMC). Cultures de MCs de divers modèles de souris knock-out par cette méthodologie représentent une approche utile pour l’identification des protéines impliquées dans les voies de signalisation de MC. En outre, nous décrivent également un protocole pour la seule cellule Fura-2 imagerie comme une technique importante pour la quantification du Ca2 + signalisation au MCs. basés sur la Fluorescence suivi de [Ca2 +]j’ai est un fiable et communément utilisé approche étude de Ca2 + signalisation des événements, y compris entrée magasin fonctionnant de calcium, qui est d’une importance capitale pour l’activation du MC. Pour l’analyse de dégranulation MC, nous décrivons un β-hexosaminidase test de libération. Le montant de la β-hexosaminidase libérée dans le milieu de culture est considéré comme un marqueur de dégranulation pour tous les trois différents sécrétoires sous-ensembles décrit dans MCs. β-hexosaminidase peut facilement être quantifié par sa réaction avec un substrat de colorigenic dans un test colorimétrique plaque de microtitration. Cette technique hautement reproductible est rentable et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Dans l’ensemble, le protocole fourni montre un rendement élevé de MCs exprimant des marqueurs de surface MC typiques, affichant des caractéristiques morphologiques et phénotypiques typiques de MCs et démontrant des réponses hautement reproductibles à sécrétagogues Ca2 +– tests d’imagerie et de la dégranulation.
Introduction
MCs jouent un rôle de premier plan au cours de la réponse immunitaire innée et acquise. Plus précisément, MCs participent à la mise à mort des agents pathogènes, tels que les bactéries et les parasites et aussi dégradent les peptides endogènes potentiellement toxiques ou des composants de venins (pour examen voir Galli et al. 20081). Le rôle physiologique de la PSC dans l’immunité innée et adaptative fait l’objet de débats houleux. Par conséquent, les nombreux écarts de données dans les études réalisées avec différents modèles de souris déficientes en MC nécessitent une réévaluation systématique des fonctions immunologiques de MCs au-delà allergie2. Mature MC est principalement localisés dans les tissus et les organes comme la peau, des poumons et intestins et se trouvent habituellement qu’en petit nombre dans le sang. MCs dérivent de précurseurs hématopoïétiques, tels que les progéniteurs de MC et terminer leur différenciation et maturation dans les micro-environnements de presque tous les tissus vascularisés1. T-cell-facteur dérivé de l’interleukine (IL) -3 favorise sélectivement la viabilité, la prolifération et la différenciation d’une population de pluripotentes de souris MCs de leurs progéniteurs hématopoïétiques3. Stem cell factor (SCF) est produite par des cellules structurelles dans les tissus et joue un rôle crucial dans le développement, survie, migrations et fonction4MC. Les propriétés de la PSC individuels peuvent différer selon leur capacité à synthétiser et stocker diverses protéases ou les protéoglycanes. Chez la souris, le MCs dits du tissu conjonctif-types se distinguent des muqueuses MCs selon leur localisation anatomique, la morphologie et contenu de l’héparine et protéases5.
Selon MCs, une augmentation de libre cytosolique Ca2 + ([Ca2 +]i) est indispensable pour la dégranulation et la production des eicosanoïdes, ainsi que pour la synthèse de cytokines et l’activation de facteurs de transcription en réponse à l’antigène et divers sécrétagogues6. Une cible majeure en aval de ces stimuli est phospholipase C, qui hydrolyse la phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycérol (DAG) et inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG active la protéine kinase C et IP3 libère des ions de Ca2 + du réticulum endoplasmique. L’appauvrissement de ces magasins active influx de Ca2 + par la membrane plasmique Ca2 + voie, menant à le pour entrée de calcium exploités (SOCE) de stocker. Ce processus est évoqué à travers l’interaction du Ca2 +-capteur, stromales interaction molécule-1 (Stim1), dans le réticulum endoplasmique avec Orai17 , ainsi que par le biais de l’activation du récepteur transitoire potentiels canonique (TRPC) canal protéines (pour examen, voir Freichel et al. 20148) dans la membrane plasmique.
Afin d’étudier le rôle physiologique de ces canaux, plusieurs pharmacologique (application de bloqueurs des canaux calciques) ou les approches génétiques sont généralement utilisés. Dans ce dernier cas, suppression de l’expression des protéines est obtenue en ciblant l’ARNm (précipitation) ou la modification de l’ADN génomique globale ou spécifique aux tissus9 suppression d’un exon codant un pore formant la sous-unité d’un canal (knockout). La disponibilité d’un bloqueur avec suffisamment de précision pour que ces canaux est limitée. En outre, l’approche knockdown exige un contrôle minutieux de son effectivité en utilisant, par exemple., Western blot de l’analyse et est entravée par l’absence d’anticorps spécifiques de la protéine ciblée canal dans de nombreux cas. Ainsi, l’utilisation de modèles de souris knock-out est toujours considérée comme l’étalon-or pour une telle analyse. Un modèle préféré in vitro pour l’étude des fonctions de MC est culture de PMC peut être isolé ex vivo comme une population en pleine maturité (par opposition à différencier les MCs in vitro de, par exemple., cellules de moelle osseuse)10 . Par rapport à la moelle osseuse provenant de MCs (BMMCs), qui sont aussi couramment utilisées pour étudier la fonction MC in vitro, la stimulation des FcεRI et bêta-hexosaminidase libération est augmentée 8 fois et 100 fois dans PMC, respectivement. Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement et culture des PMC murine, qui permet d’obtenir après que 2 semaines de culture un nombre élevé de pure du tissu conjonctif type MCs, suffisantes pour une analyse ultérieure.
Malgré les récents progrès dans l’élaboration et l’application des indicateurs de calcium génétiquement encodé, leur utilisation est encore limitée par les difficultés de livraison de gènes aux cellules cibles, en particulier, dans les cellules hautement spécialisés comme MCs cultivés primaires. En outre, ce groupe d’indicateurs fluorescents pour [Ca2 +]je mesures manque encore ratiométrique colorants avec une plage dynamique élevée. Pour ces raisons, la méthode préférée pour ratiométrique [Ca2 +]je mesure est toujours l’utilisation du colorant fluorescent « Fura-2 »11.
Actuellement, la plus couramment utilisée approche pour l’évaluation de l’activation de MC et dégranulation est la mesure de l’activité β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, un médiateur allergique, est l’un des composants de granule MC est publié conjointement avec l’histamine dans une proportion constante du MCs12. Β-hexosaminidase peut être mesuré facilement et avec précision par le biais de sa réaction avec un substrat spécifique, ce qui produit une quantité mesurable d’un produit de colorigenic qui est facilement détectable dans un dosage colorimétrique de la microplaque. Dans cet article, une application de cette technique d’analyse de dégranulation PMC en réponse à divers stimuli est signalée.
Agrégation des récepteurs haute affinité IgE plasmiques (FcɛRI) active dans MCs, une voie de signalisation intracellulaire versatile, conduisant à une libération du contenu des granules sécréteurs dans l’espace extracellulaire environnant. En plus de l’antigène spécifique, beaucoup d’autres stimuli peut activer MCs pour libérer un éventail varié d’immunomodulateurs médiateurs, comme complément anaphylatoxines (e.g., C3a et C5a)13, l’endothéline de peptide vasoconstricteur 1 (ET1)14 , bien que de nombreuses substances cationiques et médicaments provoquant des réactions pseudoallergic (e.g., icatibant)15 en se liant à MRGPRX216. Des voies de signalisation intracellulaire impliqué dans MCs MRGPR induite par la dégranulation sont mal caractérisés par rapport à la signalisation intracellulaire induite par le FcɛRI ; ces voies n’a commencé à étudier intensivement pendant les dernières d’années quelques17 après l’ identification de récepteurs16. Dans une large mesure, les canaux ioniques de la membrane plasmique impliqués dans l’entrée de calcium suivie d’une stimulation MRGPRX2 restent à être compris. Par conséquent, le présent article se concentre également sur la signalisation calcique intracellulaire et dégranulation de MCs stimulée par les agonistes de la MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèles de MC peuvent servir avec succès pour étudier la dégranulation de MC, chimiotactisme, adhérence, aussi bien quant à élucider les voies de transduction signalisation intracellulaire impliqués dans l’activation MC. Certains chercheurs utilisation humaine MCs modèles, tels que des lignées immortalisées (LAD2 et HMC1) ou MCs humaines dérivées de cordon de sang des cellules progénitrices (CD133 +) et les cellules souches du sang périphérique (CD34 +). D’autres préfèrent les rongeurs MC modèles, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait Julia Geminn d’assistance technique dans la préparation de cellules de mât et de culture. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche Collaborative transrégional (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
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