Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere og dyrke murine peritoneal mastceller. Beskriver vi også to protokoller for deres funksjonell karakteristikk: en fluorescerende imaging intracellulær gratis Ca^{2 +} konsentrasjon og en omfatter degranulering analysen basert på kolorimetrisk kvantifisering av den utgitte β-hexosaminidase.

Abstract

Mast celler (MCs), spille som en del av immunsystemet, en nøkkelrolle i å forsvare verten mot flere patogener og initiering av allergiske immunrespons. Aktivering av MCs via cross-linking av overflate IgE bundet til høy affinitet IgE reseptor (FcεRI), samt gjennom stimulering av flere andre reseptorer, starter økningen av gratis intracellulær Ca^{2 +} nivået ([Ca^{2 +}]_jeg) som fremmer utgivelsen av inflammatoriske og allergiske meglere. Identifikasjon av molekylære bestanddeler involvert i disse signalveier er avgjørende for å forstå regulering av MC-funksjonen. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for isolering typen murine bindevev MCs av peritoneal lavage og dyrking av peritoneal MCs (PMCs). Kulturer av MCs fra ulike knockout musen modeller av denne metodikken representerer en nyttig tilnærming til identifisering av proteiner involvert i MC signalnettverk trasé. Dessuten, vi også beskriver en protokoll for enkelt celle Fura-2 tenkelig som en viktig teknikk for kvantifisering av Ca^{2 +} signalering i MCs. fluorescens-basert overvåking av [Ca^{2 +}]_jeg er en pålitelig og brukte tilnærming til studere Ca^{2 +} signalisering hendelser, inkludert lager-opererte kalsium oppføring, som er av største betydning for MC aktivisering. For analyse av MC omfatter degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release analysen. Mengden av β-hexosaminidase utgitt til kultur medium regnes som en omfatter degranulering markør for alle tre forskjellige sekretoriske delsett beskrevet i MCs. β-hexosaminidase kan enkelt kvantifiseres ved sin reaksjon med et colorigenic medium i en være ferdig innen plate kolorimetrisk analysen. Denne svært reproduserbar teknikken er kostnadseffektive og krever ingen spesialisert utstyr. Overall, gitt protokollen demonstrerer en høy avkastning av MCs uttrykke typisk MC overflate markører, vise typiske morfologiske og fenotypiske egenskapene til MCs og demonstrere svært reproduserbar Svar å secretagogues i Ca^{2 +}– bildebehandling og omfatter degranulering analyser.

Introduction

MCs spille en fremtredende rolle under medfødt og ervervet immunreaksjoner. Spesielt MCs delta i drepe patogener, som bakterier og parasitter, og også redusere potensielt giftig endogene peptider eller komponenter av venoms (for gjennomgang se Galli et al. 2008¹). Fysiologiske rollen MCs i medfødte og adaptive immunitet er gjenstand for opphetet debatt. Derfor krever mange data avvik studier utført med ulike MC-mangelfull musen modeller en systematisk evaluering av immunologiske funksjoner av MCs utover allergi². Eldre MCs er hovedsakelig lokalisert i vev og organer som huden, lungene og gut, og vanligvis finnes bare i små tall i blodet. MCs avledet fra blodkreft forløpere, som MC progenitors, og fullføre sine differensiering og modning i microenvironments av nesten alle Stangeriaceae vev¹. T-cell-derived faktor interleukin (IL) -3 fremmer selektivt levedyktighet, spredning og differensiering av pluripotent innbyggere musen MCs fra deres blodkreft progenitors³. Stamcelle faktor (SCF) er produsert av strukturelle celler i vev og spiller en avgjørende rolle i MC utvikling, overlevelse, migrasjon og funksjon⁴. Egenskaper for personlige MCs kan variere avhengig av deres evne til å syntetisere og lagre ulike proteaser eller proteoglycans. I mus, er såkalte bindevev-type MCs forskjellig fra mucosal MCs etter deres anatomiske lokalisering, morfologi og innhold av heparin og proteaser⁵.

I MCs, en økning på gratis cytosolic Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_jeg) er uunnværlig for omfatter degranulering og produksjon av eicosanoids og syntese av cytokiner og aktivering av transkripsjonsfaktorer svar til antigen og ulike secretagogues⁶. En nedstrøms mål av disse stimuli er fosfolipase C, som hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverer protein kinase C og IP3 utgivelser ioner av Ca^{2 +} fra det endoplasmatiske retikulum. Utarming av disse butikkene aktiverer Ca^{2 +} tilstrømningen gjennom plasma membranen Ca^{2 +} kanaler, fører til lagre styres kalsium oppføring (SOCE). Denne prosessen er fremkalt gjennom samspillet av Ca^{2 +}-sensor, stromal samhandling molekyl-1 (Stim1), i det endoplasmatiske retikulum med Orai1⁷ samt gjennom aktivering av forbigående reseptor potensielle kanoniske (TRPC) proteiner (for gjennomgang se Freichel et al. 2014⁸) i plasma membranen.

For å studere brukes fysiologiske rollen av disse kanalene, flere farmakologisk (anvendelse av kanal blokkere) eller genetiske metoder vanligvis. I sistnevnte tilfelle, undertrykkelse av protein uttrykk oppnås ved å målrette mRNA (knockdown) eller genomisk DNA redigering med global eller vev-spesifikke⁹ sletting i en ekson koding en pore danner delenhet i en kanal (knockout). Tilgjengeligheten av en blokkering med tilstrekkelig spesifisitet for disse kanalene er begrenset. I tillegg knockdown tilnærming krever nøye kontroll på sin effektiviteten bruker, f.eks., Western blot analyse, og er hemmet av mangel på spesifikke antistoffer for målkanalen protein i mange tilfeller. Dermed er bruk av knockout musen modeller fortsatt betraktet som gullstandarden for Slike analyser. En foretrukket i vitro modell for etterforskningen av MC funksjoner er dyrking av PMCs som kan være isolert ex vivo som en fullt moden populasjon (i motsetning til skille MCs i vitro fra, f.eks., bein margtransplantasjon celler)¹⁰ . Sammenlignet med benmarg avledet MCs (BMMCs), som er også ofte brukt til å studere MC funksjon i vitro, stimulering av FcεRI og beta-hexosaminidase er versjon økte 8-fold og 100-fold i PMCs, henholdsvis. I denne artikkelen beskriver vi en metode for isolasjon og dyrking av murine PMCs, som tillater for å få etter 2 uker med dyrking mange ren bindevev skriver MCs, tilstrekkelig for videre analyse.

Til tross for framskritt i utvikling og anvendelse av genetisk kodet kalsium indikatorer, er deres bruk fortsatt begrenset av vanskeligheter i levering av gener til målcellene, spesielt i høyt spesialiserte celler som primære kulturperler MCs. I tillegg mangler denne gruppen av fluorescerende indikatorer for [Ca^{2 +}]_jeg målinger fortsatt ratiometric fargestoffer med en høy dynamisk område. For disse grunner er den foretrukne metoden for ratiometric [Ca^{2 +}]_jeg måling fortsatt bruk av fluorescerende fargestoff “Fura-2”¹¹.

For tiden, de vanligste tilnærming for vurdering av MC aktivisering og omfatter degranulering er måling av β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk megler, er en av MC granule komponentene som er co utgitt med histamin i konstant andel fra MCs¹². Β-hexosaminidase kan lett og nøyaktig måles gjennom sin reaksjon med en bestemt underlaget, som produserer en målbar mengde et colorigenic produkt som er lett synlig i en microplate kolorimetrisk analysen. I denne artikkelen, er bruk av denne teknikken for analyse av PMCs omfatter degranulering svar på ulike stimuli rapportert.

Samling av høy affinitet plasmalemmal IgE reseptoren (FcɛRI) aktiveres i MCs en allsidig intracellulær signalveien, fører til en utgivelse av sekretoriske granule innhold i omkringliggende ekstracellulære plass. I tillegg til spesifikke antigen, mange andre stimuli kan aktivere MCs å løslate en variert rekke immunmodulerende meglere, som utfyller anaphylatoxins (f.eks., C3a og C5a)¹³, vasoconstrictor peptid endothelin 1 (ET1)¹⁴ , så vel som mange kationisk stoffer og narkotika provoserte pseudoallergic reaksjoner (f.eks., icatibant)¹⁵ ved binding til MRGPRX2¹⁶. Intracellulær signalveier involvert i MRGPR-indusert MCs omfatter degranulering kjennetegnes dårlig i forhold til FcɛRI-mediert intracellulær signalering; disse veier bare begynte å studeres intensivt i løpet av de siste par år¹⁷ etter reseptor identifikasjon¹⁶. I stor grad, gjenstår plasma membranen ion kanalene involvert i kalsium oppføring etterfulgt av MRGPRX2 stimulering å bli forstått. Derfor denne artikkel fokuserer også på intracellulær kalsium signalering og omfatter degranulering av MCs stimulert med MRGPR agonister.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til tysk lovgivning retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr (offisielt godkjent av Karlsruhe regional council). 1. PMC isolasjon og dyrking av Intraperitoneal Lavage 1 Isen 2 10 mL sprøyter 3 27 G nåler 4 20 G nåler 5 Styrofoam blokk…

Representative Results

PMCs ble isolert fra 3 vill type mus (C57BL/6N) av intraperitoneal lavage og ytterligere kulturperler i RPMI medium supplert med 20% FCS og 1% penn-Strep i nærvær av vekstfaktorer (IL-3 på 10 ng/mL) og SCF på 30 ng/mL under sterilt fuktet forholdene på 37 ° C og 5% CO2. Mediet ble endret på dager 2 og 9 etter celle isolasjon. Cellen morfologi ble analysert med girkasse lys DIC imaging (se figur 1A, B). Cellen kontrasten og d…

Discussion

MC modeller kan brukes å studere MC omfatter degranulering, chemotaxis, vedheft, så vel som å belyse intracellulær signalnettverk signaltransduksjon trasé involvert i MC aktivisering. Noen forskere bruk menneskelige MCs modeller, for eksempel udødeliggjort linjer (LAD2 og HMC1) eller menneskelig MCs avledet fra ledningen blod progenitor celler (CD133 +) og perifert blod progenitor celler (CD34 +). Andre foretrekker gnager MC modeller, som foreviget (rotte basophilic leukemi RBL – 2H 3 MC linje) eller primære kulti…

Materials

RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R