ヒトの膵島抗体の電気化学発光アッセイ

Summary

ここでは、電気化学発光 (ECL) の試金を使用してヒトの膵島抗体を検出する方法を提案します。1 型糖尿病の予測に使用されるプロトコルは、他の自己免疫疾患の自己抗体を検出するために拡張できます。

Abstract

1 型糖尿病に伴う膵島抗体を特定 (T1D) つながるプロジェクトし、一般的な人口にこの病気を阻止する方法です。新規 ECL アッセイは、高い感度と特異性現在の ‘金’ 標準的なラジオ バインディング アッセイ (RBA) より膵島抗体の放射性流体相のアッセイです。ECL の試金はハイリスク、高親和性の抗体を区別する RBAs、および従来の酵素抗体法 (elisa 法で生成された低リスク、低親和性抗体によって発症 T1D の発症をより正確に定義できます。).この ECL アッセイに使用される抗原タンパク質はスルホ タグとビオチン、それぞれ表示されます。特定の抗原蛋白質を使用する各の ECL 自己抗体アッセイ研究室用使用できる前に最適化の手順が必要です。このステップはスルホ タグとビオチン ラベルの付いた 2 つの異なった抗原の比、濃度、血清酸治療の要件を決定する上で極めて重要であります。分析を実行するサンプルとスルホ-タグ共役混合血清とビオチン化キャプチャ抗原蛋白質リン酸緩衝液 (PBS)、5% ウシ血清アルブミン (BSA)。その後、サンプルは 4 ° C で一晩培養しました。同じ日に、ストレプトアビジン コート プレートはブロッカーのバッファーを用意し、4 ° C で夜通し孵化2 日目、ストレプトアビジン プレートを洗浄し、プレート上に血清抗原の混合物を転送します。プレート シェーカーにプレートを置き、低速に設定、1 時間室温で孵化させなさい。その後、プレートを再度、洗浄され、リーダーのバッファーが追加されます。プレートは、プレート リーダー機にカウントされます。結果は、内部の標準的な正と負のコントロール血清サンプルから生成されたインデックスを通じて付与されます。

Introduction

最近ステージング分類システムは、患者 T1D の初期段階の診断を支援するために作成されています。ヒトの膵島抗体の正確な検出を識別するに重要な役割やステージング発症前型 1 型糖尿病、膵島自己抗体の存在は、β 細胞の自己免疫の存在を示します。糖尿病で、β 細胞の自己免疫の初期発生から症候性疾患に影響を与える患者数および膵島抗体の種類と関連付けられているレートです変数^2,3。

自己抗体陽転、力価、膵島抗体の親和性の時代は症候性の 1 型糖尿病^{4,5,6,7,8 への進行の率に影響を与える、9,10}。最近では、ECL アッセイの開発が、感度の向上を実証しているより多く疾患特異^{10、11,12,13}に広範に検証されました。これらのアッセイは、予測と膵島抗体の早期発見による糖尿病リスクのステージングを向上します。彼らはより正確に膵島自己免疫の開始をマークし、糖尿病に関係のない低親和性、低リスクのシグナルを無視します。

ECL アッセイ、血清の抗体の場合は、流体の相でビオチン化キャプチャ抗原にスルホ-タグ共役抗原を橋します。ブリッジ後ビオチン リンカーは固相でキャッチ、ストレプトアビジン コート プレート (図 1) にスルホ タグ ECL を検出します。

このレビューでヒトの膵島抗体を持つ単一の抗体 ECL アッセイが主に利用されています。簡単に言えば、単一の ECL 法に基づくアッセイは、後ほど抗体を多重化します。マルチプレックス アッセイは、15 μ L の血清を使用しても、複数最大 10、1 つの抗体を識別するために使用できます。この単純な高スループット試金は、一般的な人口の複数の関連する自己免疫疾患の自己抗体を同時に画面に使用できます。

Protocol

1. バッファー準備 ラベル バッファー (2 x PBS、pH 7.9): 脱イオン蒸留水 (DD) の 400 mL で 100 mL の 10 x PBS、7.9 NaOH で pH を調整します。 ビオチンの 3 mM: バッファーをラベリングの 588 μ L でビオチンの 1 mg を溶解します。 スルホ タグの 3 mM: スルホ タグのバッファーをラベルの 50 μ L に溶解 150 nmol。 抗原バッファー (5 %bsa): 500 の mL の 1x PBS では、25 g の牛血清アルブミン (BSA) を追加。 0.5 M 酢酸溶液を準備します。 トリス塩酸バッファー pH 9.0 の 1.0 M: 準備 1 M トリス塩酸バッファー、および HCl で 9.0 pH 調整。 コーティング バッファー (3% ブロック A): 500 の mL の 1x PBS では、A. のブロッカーの 15 g を追加 洗浄液 (0.05% Tween 20、pbst;): 5000 mL の 1x PBS、Tween 20 2.5 mL を追加。 読み取りバッファー (界面活性剤読み取りバッファー T x 2): DD 水 500 mL、界面活性剤 (材料表) の読み取りバッファー T x 4 の 500 の mL を追加。 -20 ° C のフリーザーにビオチンとスルホ タグを格納します。注: 両方ビオチンとスルホ タグ ソリューション必要があります新鮮なラベリング手順の直前に準備する常に。 2. ラベル ビオチンとスルホ タグ ヒトの膵島自己抗原 注: より効率的なラベリングの反作用のためには、抗原、≥0.5 mg/mL、高濃度の使用をお勧めします。 ビオチンとスルホ タグのヒトの膵島自己抗原のモル比を決定します。 抗原の重量を分子量で割ることによって抗原のモル数を取得します。 1:5 (≤10 kd)、分子量の小さい方の抗原のためのモル比 1:20 より大きい分子量の抗原のためのモル比を使用 (> 50 kd)。 その濃度のモル数を除してビオチンまたはスルホ タグのボリュームを計算します。 モル比が 1:5 でビオチンまたはスルホ タグ ヒトの膵島自己抗原をミックスします。注: tris またはグリシンのバッファーにおける蛋白質は ph 7.9 サイズ スピンを使用して PBS バッファー x 2 に交換されるべき列。 ビオチンとスルホ タグは光に敏感であるのでアルミ箔を反応管をカバーします。1 時間 (RT) 室温で反応を孵化させなさい。 、インキュベーション中にプライム スピン列 x PBS バッファー調剤 2 列に 3 回。ソリューションを 2 分間 1000 × g で遠心分離機のたびに。注: 現在、ブリッジを介して、ラベリングの反応がまだ発生していると停止する必要があります。 ラベル付けされたヒトの膵島自己抗原を浄化することによってラベリングの反応を停止します。浄化するには、スピン列を介して自己抗原を渡すし、遠心分離機の 2 分間 1000 x g の列。 抗原タンパク質と最終巻の量を使用して標識抗原濃度 (μ g/μ L) を決定します。注: 大体後があります標識抗原の 90-95% 保持スピンのすべての列を渡します。 -80 ° C で標識抗原とストア標識抗原の約数 3. 最高の濃度との比率の定義 2 つの標識抗原 (チェッカー ボード試金) 試金のため 2 つの血清サンプルを高正と負の各 200 μ L の容量を持つ 1 つを準備します。 血清 4 μ L 分注し、最終巻は 20 μ L/ウェルの 96 ウェル PCR プレートまで 1x PBS を追加。図 2 aに示すように高い肯定的なサンプルと負のサンプルでは、他の半分の板の半分を使用します。 ビオチンの 10 μ L とスルホ-タグに示す図 2 aとして 2 つの異なるラベル抗原の抗原と行動のシリアル希薄をラベルの 10 μ L を追加します。1 標識抗原のシリアル希薄を水平と垂直のシリアル希薄を他の標識抗原のためを実行します。 5.3 に 9.1 で説明されている試金のステップの残りの部分を続行します。 図 2 bに示すように負のサンプルから対応する信号のそれぞれに対して高い肯定的なサンプルからの信号の比を計算します。 ビオチンの最高濃度を識別し、スルホ タグ最高または否定の最も高い比率に近い点を選択して抗原をラベル付けします。比率を識別するために否定的なサンプルから低バック グラウンド信号を検討してください。注: 測定 1 日目には、手順 6 にステップ 4 が含まれています。 4. 正しいビオチン/スルホ-タグ標識抗原濃度を用いた抗原バッファーを準備します。 チェッカー ボード分析に基づいて各抗原の合理的な濃度を選択します。 合理的なビオチン/スルホ-タグ標識抗原バッファーの抗原濃度を用いた平板あたり抗原溶液 3 mL を準備します。 5. 標識抗原と血清サンプルをインキュベートします。 注: このセクションの 2 つのプロトコル、1 つ血清酸処理せず、血清酸処理を持つものがあります。IAA の試金を除くすべての膵島抗体アッセイは、IAA 測定手順をスキップして、手順 5.6 から 5.9 から血清酸処理とプロトコルを使用して、手順 5.1 から 5.5 から血清酸処理せずに通常のプロトコルを使用します。 血清 4 μ L 分注し、最終巻は 20 μ L/ウェルの 96 ウェル PCR プレートまで 1x PBS を追加。 ウェルあたりラベル抗原溶液 20 μ L を追加します。 光を避けるために箔シール PCR プレートをカバーします。 2 時間常温シェーカー (低速) のプレートを入れてください。 4 ° C の冷蔵庫にプレートを入れて、孵化させなさい夜間 (18-24 h)。注: 5.6 から 5.9 にステップの次のプロトコルのみ IAA の試金のため設計されています、他の自己抗体アッセイは、この手順をスキップします。 ミックス 15 μ L の血清の血清サンプルごとに 0.5 M 酢酸 18 μ L で。45 分間室温でこの混合物を孵化させなさい。 ビオチンとスルホ-タグ チェッカー ボード分析に基づいて抗原を標識抗原バッファーを使用しての合理的な濃度の抗原溶液を調製します。それぞれに、ビオチンとスルホ タグを含む抗原バッファーの 35 μ L 分注にラベルが抗原、新しい PCR プレートに。 45 分インキュベーション (ステップ 5.6) の手順を完了すると、前に、抗原プレート (ステップ 5.6) の各ウェルの側に 1 M トリス pH 9.0 バッファーの 8.3 μ L を追加します。Tris バッファーと抗原の混合を制限することが重要です。すぐに転送手順 5.6、各ウェルに酸で処理する血清を 25 μ l 添加しソリューションを扇動します。光を避けるために箔シール PCR プレートをカバーします。 インキュベートするプレートができ、2, 4 ° C 冷蔵庫で皿を置くために RT でシェーカー (低速) のプレートを入れて一晩 (18-24 h)。 6. ストレプトアビジン プレートを準備します。 4 ° C の冷蔵庫からストレプトアビジン プレートを取るし、右に来て板を許可します。 ストレプトアビジン プレートは、RT では、一度は、各ウェルに 3% ブロック A 150 μ L を追加します。 箔シール PCR プレートをカバーします。 4 ° C の冷却装置でプレートを一晩インキュベートします。注:試験 2 日目には、手順 9 にステップ 7 が含まれています。 7. 転送血清/抗原は、ストレプトアビジン プレートに孵る 次の日は冷蔵庫からストレプトアビジン プレートを取り出してプレートからバッファーを破棄します。テーブルの上にいくつかの乾燥したペーパー タオルを着手し、井戸の中よりバッファーがあるまで逆さまプレートをタップします。 PBST の 150 μ L/ウェルと空ストレプトアビジン プレートを埋めるし、合計 3 つの洗浄の皿から PBST を破棄します。 転送 30 μ L の血清/抗原は、ストレプトアビジン プレートによくあたり孵る。 光を避けるために箔でプレートをカバーします。低設定では、1 時間常温で、板を振る。 8. プレートを洗浄し、読み取りバッファーを追加 破棄は、プレートから孵る。PBST の 150 μ L/ウェルを追加し、3 つの洗浄の合計のプレートから PBST を破棄します。 洗浄後、読み取りバッファーの井戸あたり 150 μ L を追加します。注: プレート、プレート リーダー機を読む方法に影響があるので、溶液中の気泡を防ぐために重要です。 9 プレートの読み取り、データの分析 プレート リーダー機のプレートをカウントします。抗体値は秒 (CPS) 当たりの数として表示されます。 相対的な指標としてプレート リーダー機から受信した抗体のレベルを伝えます。次の式からインデックスを計算します。インデックス値 = [CPS (サンプル) – CPS (マイナス コントロール)]/[CPS (肯定的な制御) – CPS (マイナス コントロール)]。 100 健常者 (すべての知られている自己免疫疾患と糖尿病の家族歴あるなしなし個人非糖尿病) の 99 パーセンタイル値に基づいて定義されている陽性カットオフを使用して正と負の抗体の結果を識別します。

Representative Results

図 2には、チェッカー ボードが表示されます。ビオチンのの 250 ng/mL と 250 ng/mL スルホ タグ標識抗原、アッセイの背景との比高の肯定的な制御サンプル、陰性対照サンプルからの信号を考慮した試金で使用される最も合理的な濃度のことを示す負のシグナル.に肯定的ですこれらの 2 つのラベル抗原濃度が最適化された T1D と健常者 100 100 の新たに診断された患者からの血清サンプルとアッセイを行った。0.023 のインデックス値は、陽性のアッセイ カットオフとして定義されました。これは健全なコントロール特性 (ROC) 曲線図 3 aに示すように、受信機を使用しての患者と 99% の特異性で感度 85% を表します。内部標準高陽性、低陽性陰性対照試料と未知試料の分析を行った。CPS のカウントの結果に表示されます表 2A 。ハイとローのポジティブ コントロールの CPS が 17903 [(19940+15866)/2 赤で強調表示されます意味] と 839 [(857+820)/2]、負のコントロールは緑、168 [(170+165)/2 で強調表示されます]。未知のサンプルのインデックスを算出」(CPSサンプル-168)/(17903-168)」。表 2Bでは、すべてのサンプルの計算されたインデックス値を示します。0.023表 2Aに赤で書かれたも CPS 値に対応する赤で書かれているより大きいインデックス値。これらの値は、健康な対照群の 99 パーセンタイルを超える肯定的な結果として定義されます。不合理な抗原濃度を使用すると、分析が高いバック グラウンドテーブル 2 Cで示すように、抗体陽性の低レベルは値 A2、A5、D1、および H4表 2 Dで灰色で強調表示のように惜しまれるでしょう。 図 1:単一の ECL IAA アッセイの二価プレート キャプチャのイラスト。スルホ タグ標識ストレプトアビジン コーティング プレートに固相に取り込まれるビオチン化キャプチャ抗原を抗原血清橋で膵島抗体。プレートにキャプチャされたスルホ タグ共役抗原の検出は、ECL を通して行われます。この図は、Yu から変更されているら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 試験陽性のカットオフを決定するための ROC 曲線です。85% の感度に対応する特異性の 99 パーセンタイルは選ばれた、0.023 のインデックス値として表されます。この試金の上限は、100 の健康コントロールから取られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3:血清 IAA ECL 信号をブロックの図。A: ECL IAA アッセイ インスリン モノクローナル抗体 (MoAb) からの信号は大幅に健常人血清添加によってブロックされました。PBS でモアブを比較すると、ひと血清は、酸で処理したとき、信号は部分的に復元。B: 4 患者血清を ECL IAA アッセイから信号は、酸処理により大幅に向上しました。この図は、Yu から変更されているら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4:多重 ECL アッセイのイラスト。抗体抗原の複合体は、特定のリンカーと液相中に形成されます。特定の抗体-抗原-リンカー錯体が同じで特定のリンカー スポットのそれぞれにも拘束されます。プレート リーダー機はスポットのさまざまなソースからの信号を区別することが、それぞれ 10 の異なるチャネル、CPS のカウントを与えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 表 1: チェッカー ボード アッセイは、濃度とビオチンの比を決定し、スルホ タグ標識抗原。A: 生 CPS を肯定的な血清とチェッカー ボード板プレートと負の血清の他の半分の半分にカウントします。ビオチン標識抗原の濃度だったシリーズで水平に薄くなり、スルホ タグ標識抗原の濃度はシリーズで垂直方向に希釈しました。B: CPS の比の値は、負の血清からの対応する CPS 数のそれぞれに対して、肯定的な血清からカウントします。黄色の強調表示された井戸を表すパネル B の否定の最高の比率この比率は 250 ng/mL のビオチンに対応し、250 ng/mL スルホ タグ ラベル パネル A 否定的な血清の下がった CPS 数での抗原濃度。この表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 表 2: 試験結果の解析。A: 生 CPS を赤と緑で強調表示されている標準的なネガティブ コントロールで強調表示されている標準的な高低ポジティブ コントロールとアッセイ プレートからカウントします。各サンプルは、アッセイに複製されました。B: 試金のプロトコルで説明されているように、インデックス値が求めた。0.023 より大きいインデックス値は、赤で強調表示され、肯定的な結果として定義されました。C: 生 CPS は、不合理な抗原濃度を使用した場合のサンプルの同じセットを持つアッセイ プレートからカウントします。これは、結果、高いバック グラウンドと通常検出されると、いくつかの低陽性パネル B に示すように、パネル D の灰色で強調表示のネガに変換されたこの表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

現在、膵島抗体は 1 型糖尿病の自己免疫の最も信頼性の高いバイオ マーカーです。彼らは小島特定の自己免疫疾患の発症をマークし、明白な疾患リスクを判定します。ECL 試金、膵島抗体の広範囲にわたって複数の国内および国際のタイプ 1 糖尿病の臨床試験で検証されました。アッセイは、感度の向上と現在の ‘金’ と比較して特異性を示している標準的な RBAs。ECL アッセイは、肥えた高親和性と RBA によって生成された低リスク、低親和性の信号からリスクの高い膵島抗体によって高い疾患特異性の優れた利点を示しています。これは単一の膵島自己抗体陽性のみである主題で気づいたが特に、タイプ 1 の糖尿病に進展していること。ほとんどのこれらの低親和性抗体はの間に失われる発見されたフォロー アップ ‘過渡正’. として振舞っている年に数ヶ月の内で行われるテスト以前に、これらの低親和性免疫交差反応性の分子に起因する可能性が高い「シングル」抗体を仮定しました。高い親和性、高いリスク膵島抗体に起因自身膵抗原による免疫。また、ECL アッセイは、糖尿病の子供たちの誕生から臨床糖尿病に続いていた年で現在の標準的な無線結合の試金 (RBA) から「セロコン バージョン」の時間を短毛能力を実証していますいます。タイミングと最初の膵島抗体膵島の先頭をマークする「セロコン バージョン」の外観を正確に正確な検出に依存する継続的な国際臨床試験、環境糖尿決定若い (テディ) で自己免疫と環境トリガーを識別するため。ECL アッセイの感度の向上のための可能な理由はすべての免疫グロブリン クラスをアッセイにキャプチャ: IgG、IgM、IgA、IgE ではなく伝統的な RBA または ELISA IgG の検出にのみ依存します。

ECL 試金、独立行政法人のようないくつかの特定の抗体の抗原に対する自己抗体の結合は健常人血清に存在いくつかのコンポーネントによって阻害されると思われます。削除またはこの抑制を解放、血清の酸処理抗原と血清は孵化させる前に行う必要があります。[図 5] のように ECL IAA アッセイとしてマウス インスリン抗体と抗原と患者血清の抗体の結合活性を大幅に増強されました。抗体アッセイに使用, 血清の酸性化は既存連結錯体の関連付けを解除する通常されます。IAA 信号のひと血清試料中の抑制、血清の酸性化によって解放の後ろのメカニズムは知られていないが、他ベース ECL アッセイ^14,15でこのメソッドが使用されています。

いくつかの場合、分子をラベル付けするとき、ビオチンまたは抗原タンパク質分子のラベリング positionsinside スルホ タグは、またはキーのエピトープ抗体に結合活性を妨げる抗体結合の近くに非常に。これは、アッセイの感度を削減し、アッセイを取り壊すことが完全に。プロシージャを表示ルーチンは、最大化または彩度あらゆる可能なラベル位置のラベル容量を最大化することによって最大のアクティビティまたは標識分子当たり信号を生成する各抗原タンパク質分子が求められます。不飽和標識抗体結合活性の中断の原因となる抗原にラベルを付ける場合、抗原タンパク質分子 (ビオチンとスルホ タグ) をラベリングのモル比を減らすことによって行わなければなりません。主要なエピトープより予約でき、不飽和ラベリング戦略を使用してほとんどの場合抗体結合活性の中断をリリースすることができます。

各測定は、内部標準高正と負の制御未知サンプルの指数の計算を含める必要があります。健常者の試金の上限近く低い肯定的な制御はアッセイ感度の監視に含めることが重要です。研究室は、長期使用のための標準的な正と負のコントロールの十分な因数を保つ必要があり、すべて因数は-20 ° C で保存する必要があります。試金の品質保証のための試金は、各サンプルの複製で実行しなければならないし、個別試験でサンプルを繰り返すことによってすべての肯定的な結果を確認すべき。3 番目のアッセイが必要第 2 確証的試金は最初の試金と同意する 2 つのアッセイの結果と一致しません (e.g。、+、+ または-、-)、正または負の結果の最終的な決定になります。

プラットフォームで単一の ECL アッセイ用設定、多重アッセイをこれらから時に展開できます。それは同時に最大 10 異なる抗体血清の小さな量の 1 つの単一の井戸を確認できます。現在、IAA を含む 4 つの膵島抗体ガダと IA-2 a、ZnT8A、T1D と一般患者の両方の親戚 T1D への進行の危険予測の重要性に等しい。現在の単一の抗体測定を使用してこれらの 4 自己抗体のスクリーニングのために利用方法が面倒で非効率的な特に大規模な集団検診。重要なは、アップ T1D 患者の 40% その他自己免疫疾患^16,17,18があります。残念ながら、これらの条件は、画面を簡単かつ安価なツールはありません。多重の ECL アッセイはありませんのみ 4 現在主要な膵島抗体アッセイを 1 つに組み合わせることができるがまた関連その他自己免疫疾患からのより多くの自己抗体アッセイをさらに組み合わせることができます。これにより、効率的に高スループットの大規模な集団で同時に複数の自己免疫性疾患のスクリーニングを行うことが可能。多重の ECL アッセイで [図 6] に示すように、液相中に形成された各抗体-抗原複合体に拘束される同じ特定のリンカー ソース スポットも。プレート リーダー機の信号受信機はスポットの 10 の異なるソースからの信号を認識することができます。ただし、非常に高い信号でスポット高いアッセイ背景を生成し、クロストークを通して近隣スポットへの干渉を引き起こします。このため、各抗体アッセイのため上限の信号はより少ない 2万カウントに限定されるべき。我々 の経験では、低い背景を持つ抗体をスポット マップを設計するときより高いカウントを持つそれらのスポットから比較的遠く配置必要があります。ECL マルチプレックスアッセイを使用して長期的な研究は、同じリンカーがアッセイの一貫性を維持する同じ自己抗体アッセイに使用することをお勧めします。

Materials

Human recombinant proinsulin protein(PINS)	AmideBio	Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein	Diamyd	rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein	Creative BioMart	IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
10x PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA-ALORICH	A7906-500G
96-well PCR plate	Fisher	14230232
Streptavidin coated plate	MSD	L15SA
Zeba sizing spin column	Thermo Fisher Scientific	89890
Twen-20	Fisher	BP337-500
HCl	Fisher	A144-500
NaOH	Fisher	SS255-1
Trizma Base	Fisher	BP152-5
EZ-Link Biotin	Thermo Fisher Scientific	PI21329
Sulfo-tag	MSD	R91AO-1
Blocker A	MSD	R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant	MSD	R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin	ThermoScience	21329
Sulfo-TAG	MSD	R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate	Fisher brand	14230232
96-Well Streptavidin plate	MSD GOLD	L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column	ThermoScience	PL208984
96-well Plate Shaker	Perkin Elmer	1296-003
Plate Reader	MSD	QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary	Beckman	Allegra X-15R