Her presentert vi metodene for å oppdage menneskelige Holme autoantistoffer bruker electrochemiluminescence (ECL) analyser. Protokollen, som brukes til å forutsi type 1 diabetes, kan utvides ved for å oppdage autoantistoffer for andre autoimmune sykdommer.
Isolerer Holme autoantistoffer forbundet med type 1 diabetes leder (T1D) vei til prosjektet og avskrekke denne sykdommen i befolkningen generelt. En roman ECL analysen er en nonradioactive væske fase analysen for Holme autoantistoffer med høyere sensitivitet og spesifisitet enn gjeldende “gull” standard radio-bindende analysen (RBA). ECL analyser kan mer presist definere utbruddet av presymptomatic T1D av skille de høy risiko, høy affinitet autoantistoffer fra lav-risiko, lav-affinitet autoantistoffer generert i RBAs og konvensjonelle enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA ). Antigen protein brukes i denne ECL analysen er merket med Sulfo-tag og Biotin, henholdsvis. Hver ECL autoantibody analysen som bruker et bestemt antigen protein trenger en optimalisering trinn før den kan brukes for laboratorium søknad. Dette er spesielt viktig å bestemme kravene for serum syre behandlinger, konsentrasjoner og prosenter av de to forskjellige antigener merket med Sulfo-tag og Biotin. For å utføre analysen, serum prøver er blandet med Sulfo-tag-konjugerte og biotinylated fange antigen protein i fosfat bufret løsning (PBS), inneholder 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Etterpå er prøvene ruges natten på 4 ° C. Samme dag, er en streptavidin-belagt plate forberedt med blokkering buffer og ruges natten på 4 ° C. På den andre dagen, vask streptavidin plate og overføre serum-antigen blandingen på platen. Plasser platen på plate shaker, sette den på lav hastighet og ruge ved romtemperatur 1t. Deretter platen vaskes igjen, og leseren bufferen er lagt. Plate så telles på plate leser maskinen. Resultatene er formidlet gjennom et stikkordregister som genereres fra standard positive og negative internkontroll serumprøver.
Et siste oppsetning klassifikasjonssystem er opprettet for å bistå med diagnose av innledende stadier av T1D hos pasienter. Nøyaktig påvisning av menneskelig Holme autoantistoffer spiller en viktig rolle i å identifisere og iscenesettelse presymptomatic type 1 diabetes, som tilstedeværelse av Holme autoantistoffer indikerer tilstedeværelse av β-celle autoimmunitet. På hvilke diabetes påvirker pasienter fra den første forekomsten av β-celle autoimmunitet til symptomatisk sykdom, forbundet med antall og type av Holme autoantistoffer, er variabel2,3.
Autoantibody serokonversjon, titer og affinitet av Holme autoantistoffer kan påvirke hastigheten på progresjon til symptomatisk type 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Nylig utviklet ECL analyser har blitt grundig validert, har vist økt følsomhet, og er mer sykdom-spesifikke10,11,12,13. Disse analyser forbedre prediksjon og iscenesettelse av diabetes risiko gjennom tidligere oppdagelse av Holme autoantistoffer. De mer presist merke initiering av Holme autoimmunitet og ignorere lav-affinitet og lav risiko signalene ikke er relevant for diabetes.
I ECL analysen bro autoantistoffer i serum, hvis Sulfo-tag-konjugerte antigen til biotinylated fange antigen i flytende fase. Etter bygge bro, er Biotin linker fanget i solid fase og oppdaget gjennom ECL av Sulfo-koden på streptavidin belagt plate (figur 1).
I denne anmeldelsen benyttes hovedsakelig enkelt antistoff ECL analyser med menneskelige Holme autoantistoffer. Kort, multiplekset antistoff analyser basert på enkelt ECL analyser vil bli diskutert. Multiplex analysen kan brukes til å identifisere flere, opptil 10, autoantistoffer i én Vel, bruke 15 µL av serum. Denne enkle høy gjennomstrømning analysen kan brukes til skjermen, samtidig, flere autoantistoffer for flere relevante autoimmune sykdommer i befolkningen generelt.
Holme autoantistoffer er de mest pålitelige biomarkers for autoimmunitet av type 1 diabetes. De markerer starten på Holme bestemt autoimmunitet og bestemme utilslørt sykdom risiko. ECL analysen, for Holme autoantistoffer, er grundig validert i flere nasjonale og internasjonale type 1 diabetes kliniske forsøk. Analysen har vist økt sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med nåværende “gull” standard RBAs. ECL analysen har vist sin overlegne fordelen for høyere sykdom spesifisitet av kresne høy affinitet og høy risiko Holme autoantistoffer fra lav-risiko, lav-affinitet signaler generert av RBA. Dette er spesielt lagt merke til i fag som er bare enkelt Holme autoantibody positiv har aldri kommet til type 1 diabetes. De fleste av disse lav affinitet autoantistoffer fant tapt under oppfølging tester gjort innen måneder til år, oppfører seg som en “forbigående positiv.” Som tidligere hypotese, disse lave affinitet “single” autoantistoffer sannsynlig skyldes immunisering med et cross-reactive molekyl. Mens høyere affinitet skyldes høyere risiko Holme autoantistoffer immunisering med Holme antigener seg. I tillegg har ECL-analyser vist evnen til å antedate av ‘serokonversjon’ fra gjeldende standard radio-bindende analyser (RBA) år hos barn med pre-diabetes, som ble fulgt til kliniske diabetes fra fødselen. En pågående internasjonale kliniske, The miljømessige determinanter av Diabetes i de unge (TEDDY), avhengig av nøyaktig påvisning å finne tidsberegningen og utseendet på den første Holme autoantibody ‘serokonversjon’ for å markere begynnelsen av Holme autoimmunitet og identifisere miljømessige utløsere. En mulig årsak til økt følsomhet i ECL analysen er at analysen fanger alle immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarere enn tradisjonelle RBA eller ELISA som stole bare på deteksjon av IgG.
I ECL analyser, for noen bestemt autoantistoffer som IAA, synes binding av autoantistoffer til antigenet å være hemmet av en komponent i normal humant serum. For å fjerne eller løslate denne hemming, var syre behandling av serumprøver nødvendig før serum ble inkubert med antigen. Som vist i [figur 5], ECL-IAA analysen, bindende aktiviteter både mus insulin monoklonale antistoffer og pasienter serum autoantistoffer antigen ble kraftig forbedret. Forsuring av serumprøver, brukes i antistoff analyser, brukes vanligvis til å fjerne eksisterende bundet komplekser. Mekanismen bak hvordan IAA signaler er hemmet i koagulasjon og utgitt av forsuring av serum er ikke kjent, men denne metoden er brukt i andre ECL basert analyser14,15.
I noen tilfeller, når merking molekyler, er Biotin eller Sulfo-tag, merking positionsinside av antigen protein molekyler på, eller nær viktige epitopes av antistoff binding, noe som kan påvirke aktiviteten binding til antistoffer. Dette vil redusere analysen følsomhet kan helt rive ned analysen. For rutine merking prosedyre, er maksimere eller metning ønskelig for hvert antigen protein molekyl generere maksimal aktivitet eller signal per merket molekyl maksimere merking kapasitet på hver mulig merking posisjon. Umettet merking skal utføres ved å redusere molar forholdet mellom merking molekyler (Biotin og Sulfo-tag) til antigen protein hvis merking på antigenet blir en mulig årsak til avbrytelse av antistoff binding aktivitet. Major epitopes kan være bedre reservert avbrudd antistoff binding aktivitet kan frigis ved hjelp av umettet merking strategien i de fleste tilfeller.
Hver analysen bør inneholde en standard høy positive og negative internkontroll for indeksen beregninger av ukjent prøver. En lav positiv kontroll nær analysens øvre grense for vanlige kontroller er viktig å inkludere for overvåking av analysen følsomhet. Laboratoriet bør holde nok dele standard positive og negative kontroller for langsiktig bruk og alle dele bør lagres på 20 ° C. For analysen kvalitetssikring, analyser må kjøres i duplikater for hver prøve og hver positivt resultat skal bekreftes ved å gjenta eksemplet i en separat analysen. En tredje analysen er nødvendig når andre bekreftende analysen ikke enig med første analysen og resultatene av to analyser, som er enig (f.eks., +, + eller-, -), blir den endelige fastsettelsen av et positivt eller negativt resultat.
Med plattformen satt for enkelt ECL analyser, kan en multiplex analysen utvides ved fra disse. Det kan samtidig avgjøre til 10 forskjellige autoantistoffer i én enkelt godt med en liten mengde serum. Foreløpig er fire Holme autoantistoffer inkludert IAA, GADA, IA-2A og ZnT8A like viktig for risiko prediksjon av progresjon til T1D i begge slektninger av pasienter med T1D og befolkningen generelt. Metodene benyttet for screening disse 4 autoantistoffer ved å bruke gjeldende enkelt autoantibody mål er arbeidskrevende og ineffektive, spesielt for storskala befolkningen screening. Viktigere, opp til 40% av pasienter med T1D har en autoimmun tilleggsbetingelse16,17,18. Dessverre, det er ingen enkel og billig verktøy til skjermen for disse betingelsene. Multiplex ECL analysen er ikke bare i stand til å kombinere 4 gjeldende store Holme autoantibody analyser i en, men også er i stand til å ytterligere kombinere flere autoantibody analyser fra andre relevante autoimmune sykdommer. Dette gjør det mulig å effektivt gjennomføre høy gjennomstrømning screening for flere autoimmune sykdommer samtidig i store populasjoner. I multiplex ECL analysen, som vist i [figur 6], vil hver antistoff-antigen komplekset dannet i væske-fase dempes til et bestemt koblingsfunksjonalitet kilde sted i samme godt. Signalmottakeren på plate leser maskinen er kunne kjenne signalene fra 10 forskjellige kilder av flekker. Men kan stedene med en ekstremt høy signal generere høy analysen bakgrunn og forårsake interferens til nærliggende steder gjennom kryss-snakk. Derfor bør øvre grense signalene for hver autoantibody analysen begrenses til mindre enn 20.000 teller. I vår erfaring, bør autoantistoffer med lavere bakgrunn plasseres relativt langt borte fra de stedene har høyere teller når stedet kartet er utformet. For langsiktige studier med multiplex ECL analyser, anbefales det at samme linker brukes til samme autoantibody analysen for å holde analysen konsekvent.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH gi DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.
Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
HCl | Fisher | A144-500 | |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |