変形可能なそで壁付けマイクロ流路では、フロー制御、パーティクル処理、チャネル ディメンションのカスタマイズ、使用中に他の再構成を提供しています。我々 は、その形状を変更することができるピンの配列のそで壁付けマイクロ流路を作製する方法をについて説明します。
マイクロ コンポーネントは、異なるキー マイクロ流体混合、分離、粒子トラップや反応などを実現するために様々 な形状を持つ必要があります。チャネル形状を維持しながら作製後も変形するマイクロ流路は高時空再構成できます。この再構成は、既存の「再構成」または「統合」マイクロ流体システムにすることが難しいこのようなキー マイクロ流体機能に必要です。長方形のピンの両端の横方向に一直線に並べられた配列から成る変形側壁とマイクロ チャネルの作製法について述べる。縦方向にピンを作動させるピンの端そしてこうして、離散化チャネルの側壁の形状を変更します。ピンのギャップは、メニスカス力によって引き起こされる隣のピンが付着したり不要な漏れを引き起こす可能性が。ピン ギャップが閉じ、エラストマーのバリアを伴う炭化水素-フッ素樹脂懸濁液ベースのギャップの充てんを紹介しています。再構成可能なマイクロ流体デバイスをこの強力な時空間チャネルで変位の流れを生成することができます。 またはチャネルのあらゆる領域で流れを止めることができます。この機能を促進し、オンデマンドでは、非-流体、気泡、粘性液体セルの処理作製の時に自分の存在や行動が知られている場合でも。
マイクロ流体デバイス – マイクロ サイズ少量の液体とは、フローを制御する – は、増加の移植性と、多くの場合、手頃な価格の医学プロシージャの「チップ」形式に小型化を提供しています。最近レビュー1で解説した、スペースおよび肯定的な特徴から成る様々 なマイクロ コンポーネントを混合、分離、粒子捕捉反応など基本的かつ主要流体機能を実現するために開発されています。
一方、多くのマイクロ流体デバイスの動作は設計段階で決定されます、マイクロ流体デバイスのいくつかの種類は、構造や動作の製造後変更を許可します。ここで我々 はこの機能を「再構成」と呼びます。マイクロ流体システムの再構成は一般に時間とデバイスの設計に必要なコストを削減や時間の経過とともにマイクロ レイアウトや機能のカスタマイズを可能します。
再構成可能なマイクロ流体デバイスは、次の 3 つのカテゴリに分類を説明しました。最初に、エラストマー チャンネルの変形により流量、使用中に変更する方向。再構成を得るためには、エラストマーのチャンネルが空圧源2、点字アクチュエータ3、または4をシールの圧縮など様々 な外部で制御可能な力によって変形されます。配線の多層流体回路、磁気モジュラー チャンネルなどの可能なモジュラー デザインに再構成可能デバイス第二に、依存とチューブ ベース マイクロ5。第三に、デバイス自体は、再構成可能なないが電極アレイ (デジタル マイクロ流体として呼ばれる)6,7とハンギング ドロップ製マイクロ流体デバイス8液滴輸送は、オンデマンドを有効にします。流れや流体の経路の切り替え。
それにもかかわらず、これらの再構成の多くはトポロジカル巨視的レベルで制限されます。たとえば、多くの統合されたマイクロ流体デバイスの流れを停止または定義済み領域のマイクロ チャンネルを折りたたむことにより流れ方向を変更します。しかし、崩壊するために領域の数と位置は再構成可能ではありません。デジタル マイクロ流体ハンドリング能力のさまざまながありますが、可能なフローは、主として各液滴の体積により限定するべき。さらに、セルの細胞培養媒体のような液滴で培養される、余分な労力が蒸発と液滴からのガス放散を防ぎ浸透圧ショックや突然の pH 変化を避けるために必要です。
チャネル機能レベルの再構成を実現するために使用の9のときにそれらを動的に再構成する機械要素の配列から成っていた可動のそで壁付けマイクロ流体デバイスを提案する.変形可能な側壁を形成するには、ピンの両端にサイドウォールのセグメントが定義されるように、小さな長方形ピンも並んでいた。ピンをスライドできる交通機関を許可する側壁の変形またはセル、泡、およびチャネル内粒子のパターニング。デッド ボリュームを最小化し、再構成を最大化するため、隣のピン間の距離を最小化する持っていた。しかし、中小企業に働く強力な毛細管内部を接続するピンの間のギャップし、マイクロの外部入力ピンのギャップ、メディア蒸発、細菌や細胞毒性汚染、最終的に細胞を引き起こし、液体のリークが発生死。そこで、長期細胞培養10環状ピン アクションに耐え漏れのない離散側壁型再構成可能流体チャネルを開発しました。
この記事では、細胞培養エリアの漸進的な増加に続いて再構成することができます分離された側壁付きマイクロ細胞培養デバイスを構築するためのプロトコルを提供します。個々 のチャネルの側壁の気密性は、蛍光イメージングを使用してテストされます。細胞培養の互換性と細胞パターニングの能力は、オンチップ細胞培養を使用して評価されます。
このマイクロ システムは、適切なチャネルの設計が前もって決定されることはできません必要に応じて変更する必要がありますたびに適しています。細胞の成長や流れやトラップのアクティブな線虫またはチャネルで予期しない動作を他の小さなオブジェクトへの移行に基づくチャネル幅およびフロー レートを調整するまたはさまざまな raw サンプルやバイオを受け入れるようにこのシステムを使用できるなど、まだデザインの時に考案されたないです。
ピン分離マイクロはフル機能を備えたマイクロ チャネル、任意の既存のマイクロ流路と比較してチャネル形状で明らかに高い再構成があると考えています。我々 がここで提供されるプロトコルには、培養時間が長く密度の下で文化を維持する細胞培養表面エリアを徐々 に拡大できるマイクロ流体デバイスが有効になります。デバイスは、あらかじめ基板、設計や製作の時期に他の考察上のタンパク質をパターニングすることがなく細胞のチャネルでパターニングをまた提供します。さらに、この再構成可能なマイクロ流体デバイスは簡単にデバイスを処理することができます非常に少数の既存のマイクロ フロー困難等の処理を実装に役立つだろう強力なチャネルで変位の流れを生成します。これは、デバイスの設計に大きな変更なしこのデバイスを使用してセルと他の微生物、ガスその他の流体間の相互作用を評価できるということを意味します。
我々 は、外部フロー制御方法としてチャネルの 1 つの入口にラプラス圧または水圧を適用する検討しています。ピンとチャネルの天井/床のすき間から空気通気路に向かって流れが生成されますので、行き止まりで液体を押すことはお勧めしません。流体の多くの操作では、このようなピンの操作は必要ありません。たとえば、混合は、1 つのピン (すなわち、前後数回 1 つだけピンを移動) によって液体をマッシュ アップによって実現できます。
デバイスの最も重要な部分は、ピンです。長さに精密、並列処理、直角度と表面品質に必要ですピン、マイクロ チャネルを形成する必要があります、スムーズに移動する必要があります、および隣接するピンの動きをガイドする必要があります。したがって、図 2Aのように図面を提出することにより精密加工を専門とする会社からピンを並べる必要あることをお勧めします。その他の幾何学的な寸法を必要とする企業と明示的な表面粗さ指示可能性があります。ただし、ピンは再利用可能な取り扱い、硝酸で時折不動態処理された場合です。
エラストマーの障壁はもう一つの重要な特徴とその形成は、デバイスの作製プロセスの最も重要なステップです。精密に加工された基地再現性と信頼性の高い結果を得るため必要になります。未硬化のバリアにピンを配置することも重要なステップです。ピンも合わせ、ギャップの充てんと気泡なし壁に埋め込まれて保管してください。これらの手順は、このマイクロ流体デバイスと共通の問題である、ピンを通して漏れを防ぐ。
このデバイスを使用してその他の一般的な問題は) 取拘束されたピン、b) 細胞死と低成長率。これらの原因が考えられますが) ピン探針高さとシリコーン スラブ金型上にフォトレジスト層の高さのエッチング、表面、および寸法ミスフィットのピン中、貧しい品質のムラ (テーパーまたは波線) エッチングが含まれます。エッチング液製剤、温度、攪拌の調整は、ピンの動きを向上させる役立つことがあります。また、ワックスや接着剤を使用せず継手試験は、問題を解決するためのヒントを提供します。可能な要因 b)、ピン、エラストマー障壁用接着剤の選択および不完全な接着剤の硬化でエラーの十分な不活性化。一部のセルは、フィブロネクチンや他のタンパク質や細胞粘着を促進するポリマーによるマイクロ チャネル内コーティングを必要があります。さらに、セル文化実践 trypsinization や遠心分離などの最適化は、死んだ細胞のマイクロを低下します。
提示作製プロトコルの制限の 1 つは、側壁の 1 つだけは分離することです。サイドウォールの両側のピン配列でビルドされている場合、チャネルの再構成がさらに向上します。ピンと長く作製手順の 2 倍が必要ですが、これは技術的に実行可能なオプションです。
The authors have nothing to disclose.
本研究は、科研費 (20800048、23700543) によって支えられました。
Oven | Yonezawa | MI-100 | |
10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
Spin coater | Active | ACT-220DII | |
Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
Nitrogen | Various | N/A | |
Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
Scalpels | Various | No.11 | |
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
Glass engraving pen | Various | N/A | |
Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |