במחקר זה, אנו מתארים מערכת ב- ovo ככלי מבטיח לבדוק אינסולין-מימטי תרכובות אורגניזם חי. היתרונות העיקריים כוללים תפוקה הולמת ועלויות מקובל, המאפשרים הזיהוי של פיטוכימיקלים עם אינסולין-מימטי מאפיינים.
רמות גלוקוז גבוהות בדם, סוכרת סוג 2 (T2DM), מחלה מטבולית multifactorial ומורכבת, נגרמות על ידי אינסולין ההתנגדות ו β-cell כשל. אסטרטגיות שונות, כולל ההזרקה של אינסולין או השימוש של תרופות sensitizing אינסולין, נרדפים כדי לטפל T2DM או לפחות להפחית את הסימפטומים. בנוסף, היישום של תרכובות צמחיות משכה תשומת לב גדלה והולכת. לכן, זה הכרחי למצוא מערכות הבדיקה יעילה כדי לזהות ולאפיין אינסולין-מימטי תרכובות. כאן פיתחנו מודל העובר אפרוח שונה, אשר מאפשרת בדיקה של תרכובות סינתטי ותמציות צמחי מרפא עם אינסולין-מימטי מאפיינים. באמצעות קרינה פלואורסצנטית מבוסס מיקרוסקופיה הראשי מסך, אשר מכמת את טרנסלוקציה של נשא גלוקוז 4 (Glut4) כדי קרום פלזמה, הצלחנו לזהות תרכובות, בעיקר תמציות צמחים, אשר יוביל לעליה של גלוקוז תאיים ריכוזים ב adipocytes. עם זאת, יעילותם של חומרים אלה דורש אימות של אורגניזם חי. לפיכך, השתמשנו ב- ovo גישה לזהות את תכונותיהם בהפחתת גלוקוז בדם. באישור ועדת אתיקה אינה דרושה מאז השימוש של עוף העוברים במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות אינו נחשב ניסוי בבעלי חיים. . הנה, היישום של מודל זה מתואר בפירוט.
סוכרת היא מחלה מטבולית מאופיינת היפרגליקמיה והיא נגרמת על ידי ליקויים-הפרשה של אינסולין או פעולה אינסולין1. תשעים אחוז מכל מקרי הסוכרת הם קטגוריה סוכרת סוג 2 (T2DM), שבו אנשים להדגים תנגודת לאינסולין בעיקר אינסולין מחסור2. מספר גורמים ידועים כדי להגביר את השכיחות העולמית של T2DM, כולל שינויים באורח החיים, במיוחד אלה הקשורים overnutrition, הזדקנות, חוסר פעילות גופנית. כ- 400 מיליון אנשים יש סוכרת ברחבי העולם על פי הבינלאומי לסוכרת הפדרציה (צה ל). מספר זה צפוי להגיע 600 מיליון בתוך 20 שנה הבאה3.
סיבוכים סוכרת הנגרמת על ידי היפרגליקמיה ותנגודת לאינסולין, כגון יתר לחץ דם, dyslipidemia, אי סבילות גלוקוז, מחלת לב כלילית, מחלת כלי דם מוחי, להוביל תוחלת החיים מופחתת באופן משמעותי באיכות4. אנשים מושפעים דורשים להורדת גלוקוז pharmacotherapy; עם זאת, השימוש של תרופות, כגון מטפורמין5 קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי דרמטי-6,–7,–8. לכן, נוסף גישות antidiabetic בטוח, זמינה וזולה נרחב נחוצים.
יש כבר ייחסה תרכובות צמחים שונות, תמציות, צמחייה בריאותיים למאפיינים אינסולין-מימטי תכונה על-ידי להתכוונן תאיים שונים. תכונה חשובה היא גירוי של רוברטסונית של נשא גלוקוז 4 (GLUT4) קרום פלזמה מעל תאי אחסון תאיים, וכתוצאה מכך ספיגה מוגברת של גלוקוז בשריר, רקמת שומן, בהעדר אינסולין, המכונה מאפייני אינסולין-מימטי9. בעבר, אנחנו מיושמת גישה מבוסס מיקרוסקופיה של קרינה פלואורסצנטית לכמת את התהליך טרנסלוקציה של GLUT410. ניתוח של תמציות צמחים רבים מן הספרייה תמצית11 שימוש assay הזה הביא הזיהוי של מועמדים מבטיחים. עם זאת, בדיקות נוספות היצורים החיים נדרשים. הגישה המתוארת בפירוט רב את הנייר הזה, מודל העובר אפרוח שונה, הוכיחה להיות דוגמנית מבטיח לזיהוי חומרים עם אינסולין-מימטי מאפיינים. הוא מייצג כלי אטרקטיבי מילוי הפער רחב בין הפריה מחקרים ב- vivo ומציע מספר יתרונות בהשוואה למערכות קיימות כגון עלויות מקובלת, נהלי הטיפול הפשוט תפוקה הולמת. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה אינה נדרשת.
וזמינותו הט-קאם היא מערכת חלופה מבחן בשימוש נרחב לניסויים בבעלי חיים התעשייה12. המערכת ב- ovo המתוארים כאן מייצג גירסה שונה של מצלמת הט וזמינותו. בעוד בצורתו המקורית, מצלמת הט ניסויים מבוצעים ללמוד את מאפייני מעצבן של תרכובות ניסוח או הניתוח של אנגיוגנזה14,15,16, לנו יש להתאים את הגישה כדי לבדוק תרכובות עם מאפיינים אינסולין-מימטי בשם12. על פי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי, ניסויים עם עוברי העופות שאינם סס במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות לא צריך הרשאה על ידי ועדת האתיקה מאז ניסויים אלו אינם נחשבים ניסויים בבעלי חיים. מחקרים אחרונים הוכיחו ההתאמה של המערכת ב- ovo לאפיין את היעילות של תמציות צמחים שנבחרו, אשר זוהו GLUT4 רוברטסונית מבוססת על המסך הראשי10, כדי להפחית את רמות הגלוקוז בדם, היעדרות של אינסולין12,13. נקודות קריטיות עבור הופעה ממש טובה של המערכת ב- ovo כוללים: הראשון, תרבית אמין אספקת הביצים. לומן. עוף חום קלאסי הוא בחירה טובה של הגזע. שנית, היישום של רעילות בדיקות כדי לא לכלול את ההשפעות הרעילות של הצרכים מתחם ובדוקים להיעשות. בנוסף, הכנת כלי דם מתאים עבור איסוף דם חשובה. חשוב למנוע את חיתוך כלי גדול ממברנה chorioallantoic עצמו, כמו זה יכול להוביל לאובדן שאינו עדיפה של דם. יתר על כן, לפני הספינה הוא נחתך על רצועת ה-pH, זה חייב להיות טפחו יבש באמצעות נייר סינון כדי למנוע דילול הדם שנאספו. בסופו של דבר, מספר מספיק של ניסויים נראה חשוב. מומלץ להשתמש לפחות 10 ביצים על כל נקודת זמן, וחזרה לתרגיל של הניסוי בהתאמה.
באופן טבעי, ישנן כמה מגבלות של גישה זו ב- ovo . מכיוון שצריך עד 30 דקות עד שהחומרים הם נספג דרך קרום הדקה באים במגע קרוב עם קרום chorioallantoic, זה אינה מאפשרת לכמת מענה מהיר של העובר למתחם יישומית. יתר על כן, תרכובות מסוימות עשויים להיות רעילים בריכוז יישומית, אשר לעתים קרובות התוצאות נגעים של כלי דם ברקמה chorioallantoic. לפיכך, cytotoxicity בדיקות בהתבסס על דגירה לטווח ארוך של תרכובות למשך 24 שעות מופיע סבירה. לבסוף, מצאנו כי מערכת מאגר המשמש עבור היישום של תרכובות יש השפעה משמעותית על הביצועים של וזמינותו. 12 . כעת, HBSS המאגר משמש כי התוצאה היא ההשפעה הקטן ביותר על רמות הגלוקוז בדם של העובר.
עבור יישומים עתידיים, המאגר הנוסף מערכות כחלופה HBSS עשוי להיבדק. יתר על כן, ההשפעה של תמציות צמחים על פרמטרים נוספים דם כגון כולסטרול, טריגליצרידים או lipoproteins יכול להיות שאלה אטרקטיבי.
המערכת החדשה שלנו ב- ovo הוא כלי מבטיח וחשוב לבחון חומרים עם מאפיינים אינסולין-מימטי של אורגניזם חי ללא הצורך של ניסוי בבעלי חיים. לכן, הוא ממלא את הפער בין הגישות הפריה , ב- vivo . לעומת הקיים ב- ovo דגם מערכות17 שאין צורך לזירוז סוכרת על ידי טיפול streptozotocin (STZ), כפי שאנו משתמשים עוברי ביום 10 או 11 של דגירה. בשלב זה, ייצור האינסולין לא התחיל, אך העוברים כבר רגישים לאינסולין. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה ייתכן שיהיה צורך אם העוברים בגילאי 14-17 ימים נמצאים בשימוש17. יתר על כן, בהשוואה לאסטרטגיות אלטרנטיביות18, מתחם היישום כפי שמתואר כאן הוא פחות מזיקים ולא מייגעת, הגדלת ניסיוני דרך. תוריד מחירים.
יחדיו, זה ב- ovo הגישה היא מערכת אטרקטיביים אם תופעת דם-הפחתת חומר אינסולין-מימטי צריך להיבחן. אורגניזם חי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היה ממומן על ידי אוסטריה מחקר קידום הסוכנות (FFG; מספר הפרוייקט 850681), יוזמת האוניברסיטה של יישומי מדעי העליונה אוסטריה קרנות בסיסי (פרוייקט GlucoSTAR) ואל המרכז לחדשנות טכנולוגית בתחום הרפואה (מתוזמן במרכז) זה מקבל בסיסי מימון על ידי מחוז של אוסטריה עילית.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |