I denne studien beskriver vi et i-ovo -system som en lovende verktøy for å teste insulin-mimetic forbindelser i en levende organisme. De viktigste fordelene inkluderer tilstrekkelig overføringshastighet og akseptabel kostnader som aktiverer identifisering av fytokjemikaliene med insulin-mimetic egenskaper.
Forhøyet blodsukker i type 2 diabetes mellitus (T2DM), en kompleks og multifaktoriell metabolsk sykdom, er forårsaket av insulin resistens og β-celle feil. Ulike strategier, inkludert injeksjon av insulin eller bruken av insulin-sensitiverende narkotika, ble forfulgt for å behandle T2DM eller i det minste redusere symptomene. I tillegg har programmet av urte forbindelser fått økende oppmerksomhet. Dermed er det nødvendig å finne effektive test-systemer for å identifisere og karakterisere insulin-mimetic forbindelser. Her utviklet vi en modifisert chick embryoet modell, som gjør testing av syntetiske stoffer og urte ekstrakter med insulin-mimetic egenskaper. Bruke en fluorescens mikroskopi-baserte primære skjerm, som quantifies translokasjon av glukose transportør 4 (Glut4) til plasma membranen, klarte vi å identifisere forbindelser, hovedsakelig urte ekstrakter, som fører til en økning av intracellulær glukose konsentrasjonene i adipocytter. Men krever effekten av disse stoffene ytterligere bekreftelse i en levende organisme. Derfor brukte vi i ovo tilnærming til å identifisere deres blod glukose-reduserende egenskaper. Godkjennelse fra en etisk komite er ikke nødvendig siden bruk av kylling embryoer under de første to-tredjedeler av embryonale utvikling er ikke et dyr eksperiment. Her, er anvendelse av denne modellen beskrevet i detalj.
Diabetes mellitus er en metabolsk sykdom karakterisert ved hyperglykemi og er forårsaket av feil i insulinsekresjon eller insulin handling1. Nitti prosent av alle diabetes tilfeller er kategorien type 2 diabetes mellitus (T2DM), der enkeltpersoner demonstrere insulinresistens og mest insulin mangel2. Flere faktorer er kjent for å øke global forekomsten av T2DM, inkludert endringer i livsstil, spesielt de som er knyttet til overnutrition, aldring og fysisk inaktivitet. Ca 400 millioner mennesker har diabetes mellitus verden ifølge International Diabetes Federation (IDF). Dette er forventet å nå 600 millioner innen de neste 20 år3.
Diabetiker komplikasjoner forårsaket av hyperglykemi og insulinresistens, som hypertensjon, dyslipidemi, glukose intoleranse, koronar hjertesykdom og cerebral vaskulær sykdom, føre til en betydelig redusert levetid og kvalitet4. Berørte personer krever glukose-senking farmakoterapi; bruken av narkotika, for eksempel metformin5 er imidlertid ofte forbundet med dramatiske bivirkninger6,7,8. Derfor videre er antidiabetika tilnærmingsmåter som er rent, allment tilgjengelig og rimelig nødvendig.
Forskjellige urte forbindelser, ekstrakter, planter og nutraceuticals har blitt tilskrevet funksjonen insulin-mimetic egenskaper ved modulerende ulike cellulære funksjoner. En viktig funksjon er stimulering av translokasjon av glukose transportør 4 (GLUT4) til plasma membranen fra intracellulær oppbevaringsrom, noe som resulterer i en økt opptak av glukose i muskler og fettvev i fravær av insulin, kjent som insulin-mimetic egenskaper9. Tidligere har implementert vi en fluorescens mikroskopi-basert tilnærming for å kvantifisere translokasjon prosessen med GLUT410. Analyse av mange planteekstrakter fra en ekstra biblioteket11 ved hjelp av denne analysen resulterte i identifikasjon av lovende kandidater. Imidlertid kreves ytterligere tester i levende organismer. Tilnærming som er beskrevet i detalj i dette papiret, en modifisert chick embryoet modell, har vist seg for å være en lovende modell for å identifisere stoffer med insulin-mimetic egenskaper. Det representerer en attraktiv verktøyet fylle det store gapet mellom i vivo og in vitro studier og tilbyr flere fordeler sammenlignet med eksisterende systemer som akseptabelt kostnader, enkel håndteringsprosedyrer og tilstrekkelig overføringshastighet. I tillegg er tillatelse fra en etisk komite ikke nødvendig.
HET-CAM analysen er en mye brukt alternativ testsystem å dyreforsøk i bransjen12. I-ovo systemet beskrevet her representerer en modifisert versjon av HET-CAM analysen. Mens i sin opprinnelige form, HET-CAM eksperimenter utføres for å studere de irriterende for forbindelser og utforming eller analyse av angiogenese14,15,16, vi har tilpasset tilnærming til test forbindelser med antatte insulin-mimetic egenskaper12. Ifølge direktiv 2010/63/EU trenger eksperimenter med ikke-klekket avian embryo under de første to-tredjedeler av embryonale utvikling ikke tillatelse fra en etisk komite siden disse eksperimentene ikke anses dyreforsøk. Nyere studier har vist hensiktsmessigheten av i-ovo systemet å karakterisere effekten av valgte urte ekstrakter, som har blitt identifisert i en GLUT4-translokasjon-baserte primære skjermen10, redusere blodsukkernivået i den fravær av insulin12,13. Kritiske punkter for god ytelse ved i-ovo systemet inkluderer: første, en pålitelig oppdretter levere befruktede egg. Lohmann klassisk Brun kyllingen er et godt valg av rasen. Second, implementeringen av toksisitet tester utelate toksiske effekter på undersøkte sammensatte må gjøres. I tillegg er utarbeidelsen av en egnet blodåre for blod samling viktig. Det er viktig å unngå skjæringen av store fartøy i chorioallantoic membran, da dette kan føre til ikke å foretrekke tap av blod. Videre før fartøyet er kuttet på pH stripen, den har å bli klappet tørr bruke filter papir for å hindre fortynning samlet blod. Til slutt, et tilstrekkelig antall eksperimenter synes å være viktig. Vi anbefaler at du bruker minst 10 egg for hvert punkt, og en tre-fold gjentagelse av respektive eksperimentet.
Naturligvis, det er noen begrensninger av denne i ovo . Siden det tar opptil 30 minutter før stoffene er absorbert gjennom eggeskallet membran og kommer i nærkontakt med chorioallantoic membran, er det ikke mulig å kvantifisere en rask respons av embryoet til anvendt sammensatte. Videre kan noen forbindelser være giftig i anvendt konsentrasjon, som ofte resulterer i lesjoner i blodårene i chorioallantoic membranen. Dermed vises cytotoksisitet tester basert på langsiktige inkubering av forbindelser i 24 timer rimelig. Til slutt, vi fant at bufferen systemet brukes for anvendelse av forbindelsene har en betydelig effekt på resultatene av analysen. 12 for tiden HBSS bufferen brukes fordi det resulterer i minste effekten på blodsukkernivået av embryoet.
For framtidige applikasjoner, ekstra buffer systemer som et alternativ til HBSS kan testes. Videre kan påvirker urte ekstrakter ytterligere blod parametere som kolesterol, triglyserider eller lipoproteiner være et attraktivt spørsmål.
Våre nye i ovo -system er et lovende og viktig verktøy for å teste stoffer med insulin-mimetic egenskaper i en levende organisme uten behovet av et dyr eksperiment. Derfor fyller det gapet mellom in vitro og i vivo tilnærminger. I forhold til eksisterende i-ovo modell systemer17 er det ikke nødvendig å indusere diabetes ved streptozotocin (STZ) behandling, som vi bruker embryoer på dag 10 eller 11 av inkubasjon. På dette stadiet, insulin produksjon startet ikke, men embryoene er allerede insulin følsom. I tillegg kan tillatelse fra en etisk komite være nødvendig hvis embryo alderen 14-17 dager er brukt17. Videre er i forhold til alternative strategier18, sammensatte programmet som beskrevet her mindre skadelig og arbeidskrevende, øke eksperimentelle lakkeringsverksteder priser.
Til sammen har dette i ovo er tilnærming en attraktiv system hvis en blod-redusere effekten av en insulin-mimetic stoffet skal bli testet i en levende organisme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av det østerrikske Research forfremmelse Agency (FFG, prosjektnummer 850681), University of Applied Sciences øvre Østerrike grunnleggende finansiering initiativ (project GlucoSTAR) og Center for teknologisk innovasjon i medisin (tidsbestemt Center) som mottar grunnleggende finansiering av provinsen i øvre-Østerrike.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |