नींबू के विशिष्ट और सटीक का पता लगाने हरियाली रोगज़नक़ कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी. खट्टे पत्ती ऊतक के नमूनों पर पारंपरिक पीसीआर का प्रयोग
Summary
खट्टे हरियाली एक विशेष रूप से विनाशकारी खट्टे फसलों विश्व स्तर पर प्रभावित रोग है । यहां प्रस्तुत है एक सरल विधि का उपयोग कर पीसीआर और खट्टे पत्ती ऊतक के जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण खट्टे हरियाली रोगज़नक़, कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी की सटीक और सटीक पहचान के लिए ।
Abstract
नींबू हरियाली, huanglongbing के रूप में भी जाना जाता है, एक विनाशकारी खट्टे खट्टे खेतों दुनिया भर में तबाह रोग है । इस रोग विषम पीले पत्ते mottling, नस तेजाब, पत्तियों, जड़ क्षय, और अंत में, खट्टे संयंत्र की मौत का कारण बनता है । जब संक्रमित, खट्टे पौधों विकास अवरुद्ध है और फूलों के मौसम से बाहर का उत्पादन । ये फूल शायद ही कभी फल उपज, और उन है कि छोटे, कड़वा, अनियमित आकार खट्टे फल है कि वांछनीय नहीं है उपज है । यह रोग एशियाई खट्टे psyllid, Diaphorina सिट्री, और संक्रमित खट्टे ऊतक के भ्रष्टाचार के द्वारा फैला हुआ है । रोगज़नक़ खट्टे संयंत्र के भीतर एक लंबी और परिवर्तनशील गर्मी की अवधि है-कभी साल, इससे पहले कि लक्षण दिखाई देते हैं । संस्कृति के लिए प्रयास इन विट्रो में इस रोगज़नक़ असफल हो गया है, संभवतः संक्रमित खट्टे ऊतक के भीतर रोगज़नक़ की कम और असमान एकाग्रता के कारण, या क्योंकि यह पर्यावरण की वृद्धि के लिए अनुकूल परिस्थितियों को दोहराने के लिए मुश्किल है रोगज़नक़ । यह बहुत ही बीमारी की पहचान करने से पहले यह फैल गया है मुश्किल है, अपनी लंबी गर्मी की अवधि के कारण और ‘ शोधकर्ताओं ने संस्कृति के लिए अक्षमता रोगज़नक़ । एक परिणाम के रूप में, रोग ही स्पष्ट हो जाता है के बाद अचानक एक खट्टे किसान पूरी उपज को नष्ट । यहां प्रस्तुत खट्टे हरियाली रोगज़नक़ का सही और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक विधि है, कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी. एक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट और पीसीआर का उपयोग करना । इस विधि सरल, कुशल लागत प्रभावी है, और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय । इस विधि किसी भी खट्टे ऊतक पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता; हालांकि, यह संभवतः ऊतक में मौजूद रोगज़नक़ की मात्रा तक सीमित है । फिर भी, इस विधि खट्टे किसानों को पहले संक्रमित खट्टे पौधों की पहचान करने की अनुमति होगी, और इस विनाशकारी रोग के प्रसार पर अंकुश लगाने से पहले यह आगे फैल सकता है ।
Introduction
नींबू हरियाली, huanglongbing के रूप में भी जाना जाता है, खट्टे पेड़ों की एक महत्वपूर्ण नुकसान हुआ है । एक प्रतिनिधि प्रकरण फ्लोरिडा, जहां रोग के लिए २४४,०००,००० बक्से से फ्लोरिडा ऑरेंज बक्से के उत्पादन में ७०% की कमी के कारण पूर्वानुमानित है १९९७-१९९८ सीजन में ७०,०००,००० बक्से के रूप में २०१६-२०१७ सीजन1। फ्लोरिडा में खट्टे पेड़ों की ९०% से अधिक2संक्रमित हैं, और यह अनुमान है कि फ्लोरिडा खट्टे उद्योग के बारे में १,०००,०००,००० डॉलर हर साल खट्टे रोगों के कारण खो देता है, जिसमें खट्टे हरियाली एक प्रमुख भूमिका निभाता है3। नींबू हरियाली आक्रामक एशियाई खट्टे psyllid Diaphorina सिट्री द्वारा मुख्य रूप से फैला है, लेकिन यह भी संक्रमित ऊतक के भ्रष्टाचार के द्वारा फैलता जा सकता है। रोग नसों के तेजाब का कारण बनता है, विषम पीले पत्ते mottling, समय से पहले पत्तियों, टहनी शीर्षारंभी क्षय, जड़ क्षय, और पौधों की मृत्यु । महत्वपूर्ण बात, रोग खट्टे संयंत्र मौसम, जो शायद ही कभी फल का उत्पादन से बाहर फूलों का उत्पादन करने का कारण बनता है । फल है कि संक्रमित खट्टे पौधों द्वारा उत्पादित है अपरिपक्व, हरे, और कड़वा चखने4हैं ।
इस विधि का उद्देश्य सही है और ठीक करने के लिए गतिशील जीवाणु कैंडिडेटस liberibacter एसपीपी., खट्टे हरियाली के प्रेरणा का एजेंट, संक्रमित खट्टे पेड़5के फ्लोएम के भीतर रहने की पहचान है । जीनोमिक डीएनए पूरी पत्ती ऊतक है, जो जीवित बैक्टीरिया शामिल से निकाला जाता है । इस निकाली जीनोमिक डीएनए पारंपरिक पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है, जहां oligonucleotides जीवाणु 16S rDNA अनुक्रम के पूरक इस अनुक्रम बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है. Oligonucleotides एक खट्टे FBOX जीन के पूरक एक आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । हम इस पद्धति का उपयोग करें, क्योंकि यह पिछले अनुसंधान6में सफल साबित किया गया है चुना है ।
इस विधि सरल, अपेक्षाकृत सस्ती होने का स्पष्ट लाभ है, और किसी भी सामांय रूप से सुसज्जित जैव रसायन प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने में सक्षम । इसके अलावा, पीसीआर इस रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सबसे सटीक और सटीक तरीका है, इस रोगज़नक़ संवर्धन की कठिनाई के कारण7, और रोगज़नक़ की क्षमता जीवित है और एक स्पर्शोन्मुख मेजबान8के भीतर साल के लिए पुन: पेश करने के लिए । कई अलग विशेषता पीसीआर परख सफलतापूर्वक इस रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, पारंपरिक पीसीआर सटीक और विशिष्ट का पता लगाने के लिए सरल परख रहता है, विशेष रूप से स्पर्शोन्मुख8मेजबान के भीतर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह महत्वपूर्ण है कि सभी चरणों का पालन कर रहे है बिल्कुल इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों को प्राप्त करने के लिए । पूरे पत्ती ऊतक इस प्रदर्शन के दौरान इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, प्रोटोकॉल सैद्धांतिक रूप स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अवधारणा, H.C. और जेड. क्यू. एफ.; जांच, एच. सी., जे. सी., और जेड. क्यू. एफ; संसाधन, जेड. क्यू. एफ.; लेखन-मूल मसौदा, आई. ए. पी.; लेखन – समीक्षा एवं सम्पादन, आई. ए. पी., जे. सी., एच. सी., एस. एल. टी., तथा जेड. क्यू. एफ.; विज़ुअलाइज़ेशन, एच. सी.; पर्यवेक्षण, जेड. क्यू. एफ.; अनुदान प्राप्ति, जेड. क्यू. एफ और एफ. क्यू. एल.
परियोजना के एक दक्षिण कैरोलिना शिक्षक गुणवत्ता में सुधार उच्च शिक्षा राज्य अनुदान शीर्षक से समर्थन किया, मध्यम ग्रेड विज्ञान संयंत्र प्रक्रियाओं, संरचनाओं के शिक्षकों के ज्ञान को बढ़ाने, और कार्यों सगाई के माध्यम से संयंत्र में विज्ञान अनुसंधान संयंत्र ( विज्ञान)
यूनाइटेड सॅटीस एजुकेशन डिपार्टमेंट (प्रेजेंट नंबर 84.367 बी) द्वारा सम्मानित फंड
लेखकों को संक्रमित खट्टे sinensis वालेंसिया से जीनोमिक डीएनए नमूने प्रदान करने के लिए फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के डॉ नियन वांग का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
