Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.
Summary
Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.
Introduction
Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-20171. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas2, e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante3. Cítrica greening é espalhada principalmente pelos psilídeos cítricos asiáticos invasivo Diaphorina citri, mas também pode ser transmitida por enxertia de tecido infectado. A doença causa amarelecimento das veias, manchas assimétrica folha amarela, desfolha prematura, dieback do galho, cárie de raiz e morte da planta. Importante, a doença causa a planta cítrica produzir flores fora de época, que raramente produzem frutos. A fruta que é produzida por plantas cítricas infectadas é imaturos, verde e amargo sabor4.
A finalidade desse método é exatamente e precisamente identificar a bactéria motile Candidatus liberibacter spp., o agente causador da cítrica greening, vivendo dentro do floema de árvores cítricas infectados5. DNA genômico é extraído do tecido da folha inteira, que contém a bactéria viva. Este DNA genômico extraído é usado como um modelo para o PCR convencional, onde oligonucleotídeos complementares a sequência de rDNA 16S da bactéria são utilizados para amplificar esta sequência. Oligonucleotídeos complementares a um gene de caixa cítrico são usados como um controle interno de amplificação. Nós escolhemos usar esse método, porque provou ser bem sucedido na anterior pesquisa6.
Este método tem a vantagem de ser simples, relativamente barato e capaz de ser realizado em qualquer laboratório de bioquímica normalmente equipado. Além disso, PCR continua a ser o método mais exato e preciso para detectar este patógeno, devido à dificuldade de cultivo deste patógeno7e capacidade do patógeno sobreviver e reproduzir-se durante anos dentro de um hospedeiro assintomático8. Muitos ensaios PCR de especialidade diferentes foram usados para detectar com sucesso este patógeno; no entanto, PCR convencional permanece o ensaio mais simples para a deteção de preciso e específico, especialmente dentro de hospedeiros assintomáticos8.
Protocol
Representative Results
Discussion
É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados11. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceituação, H.C. e z. p. F.; Investigação, H. C., J. C e z. p. F; Recursos, z. p. F.; Escrevendo – projecto Original, I. r. P.; Escrita – revisão e edição, I. r. P., J. C., C. H., S. L. T. e z. p. F.; Visualização, H. C.; Supervisão, z. p. F.; Financiamento de aquisição, z. p. F e F. p. L.
Projeto apoiado pela Carolina do Sul melhorar professor qualidade ensino superior estado subvenção intitulado, conhecimento de processos de planta realçando médio notas ciência dos professores, estruturas e funções através do engajamento em pesquisa de Ciências de planta (planta Ciência)
Fundos premiados pelo United Sates departamento de educação (CFDA número 84.367B)
Os autores gostaria de agradecer Dr. Nian Wang da Universidade da Flórida para fornecer amostras de DNA genômicas de infectados Valência Citrus sinensis .
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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