Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti
Summary
Narenciye Greening narenciye bitkileri genel olarak etkileyen özellikle yıkıcı bir hastalıktır. Burada sunulan basit bir yöntem PCR ve narenciye yaprak doku genomik DNA ekstraksiyon narenciye greening patojen olan liberibacter spp. doğru ve kesin tanımlaması için kullanıyor
Abstract
Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye çiftlikleri küresel ravaging yıkıcı bir narenciye hastalıktır. Bu hastalık asimetrik sarı yaprak distrofileri, damar sararma, yapraksızlaşma, kök çürümesi ve sonuçta, narenciye bitkinin ölümüne neden olur. Ne zaman bulaştırmak, narenciye bitki büyüme bodur ve çiçek sezon dışı üretmek. Bu çiçekler, nadiren meyve verim ve bu da küçük, sert, düzensiz şekilli Narenciye meyve bu verim tercih edilmez. Bu hastalık Asya narenciye psyllid, Diaphorina citri ve virüslü narenciye dokusunun aşılama tarafından yayılır. Patojen narenciye bitki içinde bir uzun ve değişken kuluçka dönemi vardır — bazen belirtiler ortaya çıkmadan önce yıl. Bu patojen vitro kültür girişimlerini muhtemelen düşük nedeniyle başarısız oldu ve düzensiz konsantrasyon patojenin içinde narenciye doku enfekte veya çevre çoğaltmak zor olduğundan büyümesine elverişli koşullar patojen. Bu, onun uzun bir kuluçka dönemi ve araştırmacıların patojen kültür yetersizlik nedeniyle yayıldı önce hastalık tespit etmek çok zordur. Sonuç olarak, hastalık sadece aniden bir narenciye çiftçinin tüm verim yok sonra ortaya çıkıyor. Burada sunulan narenciye greening patojen olan liberibacter spp. genomik DNA ekstraksiyon kiti ve PCR kullanarak doğru ve belirli algılanması için bir yöntemdir. Bu yöntem basit, verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Bu yöntem narenciye herhangi bir doku kullanmak için adapte edilebilir; Ancak, bu potansiyel olarak patojen dokuda mevcut miktarı ile sınırlıdır. Yine de, bu yöntem daha önce virüslü narenciye bitki tanımlamak narenciye çiftçilerin izin ve daha da yayılabilir önce yıkıcı bu hastalığın yayılmasını engellemek.
Introduction
Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye ağaçları önemli bir kaybına neden oldu. Florida, bir % 70 azalma Florida portakal kutu üretiminde 244 milyon kutularından 1997-1998 sezonunda 70 milyon kutularına aynı derecede-in 2016-2017 sezon1neden olduğu hastalık nerede tahmini bir temsilcisi durumdur. Florida narenciye ağaçları % 90’ı enfekte2var ve bu Florida narenciye sanayi neyin narenciye greening3önemli rol oynar, narenciye hastalıklar nedeniyle her yıl yaklaşık bir milyar dolar kaybeder tahmin edilmektedir. Narenciye greening öncelikle invaziv Asya narenciye psyllid tarafından Diaphorina citri, yaymak ama da virüslü dokusunun. aşılama tarafından yayılır Damarlar, asimetrik sarı yaprak distrofileri, erken yapraksızlaşma, dal dieback, kök çürümesi ve ölüm bitki sarılık hastalığı neden olur. Önemlisi, hastalık nadiren meyve üreten çiçek Sezon dışında üretmek için narenciye bitki neden olur. Virüslü narenciye bitkiler tarafından üretilen meyve olgunlaşmamış, yeşil ve acı4tatma.
Bu yöntemin amacı doğru olduğunu ve tam olarak hareketli bakteri olan liberibacter spp., narenciye greening virüslü narenciye ağaçları5phloem içinde yaşayan, hastalığının tanımlar. Genomik DNA canlı bakteri içeren bütün yaprak dokudan elde edilir. Bu ayıklanan genomik DNA’yı nerede oligonucleotides bakteri’nın 16S rDNA dizisine tamamlayıcı bu dizi yükseltmek için kullanılan geleneksel PCR için şablon olarak kullanılır. Oligonucleotides bir narenciye FBOX gen için tamamlayıcı bir iç amplifikasyon denetimi olarak kullanılır. Bu yöntemi kullanmak seçtik çünkü önceki araştırma6‘ başarılı olmak için kanıtlanmış oldu.
Bu yöntem basit, nispeten ucuz ve herhangi bir normal donanımlı Biyokimya Laboratuarı’nda gerçekleştirilen mümkün olmanın avantaj vardır. Buna ek olarak, PCR Bu patojen7ve patojen’ın yeteneği hayatta kalmak ve yıl için asemptomatik ana bilgisayar8içinde yeniden zorluğu nedeniyle bu patojen tespit için en doğru ve kesin yöntem kalır. Birçok farklı uzmanlık PCR deneyleri başarılı bir şekilde bu patojen tespit etmek için kullanılmıştır; Ancak, geleneksel PCR basit tahlil için doğru ve belirli algılama, özellikle asemptomatik ana bilgisayarlar8içinde kalır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm adımları tam olarak en iyi deneysel koşullar elde etmek için takip çok önemlidir. Bütün yaprak dokusu bu gösteri sırasında kullanılan; Ancak, protokol teorik olarak her türlü bitki doku eklemek için değiştirilebilir. Daha önce araştırmacılar, bütün yaprak doku yerine yaprak damar dokusu, genomik DNA elde ve benzer sonuçlar11elde. Narenciye FBOX gene ile karşılık gelen grup görünmesini başarısız olursa, sonuç geçersiz olur ve bir veya daha fazla çal?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kavramsallaştırma, HC ve Z. s. F.; Soruşturma, H. C., J. C ve Z. s. F; Kaynaklar, Z. s. F.; Yazma – orijinal taslak, ı. A. s.; Yazma-İnceleme ve düzenleme, ı. A. s., J. C., H. C., S. L. T. ve Z. s. F.; Görselleştirme, H. C.; Gözetim, Z. s. F.; Satın alma, Z. s. F ve F. s. L. finansman
Bir South Carolina iyileştirilmesi öğretmen kalitesi yüksek öğrenim durumu başlıklı Grant tarafından desteklenen proje, artırılması orta sınıflarda Bilim Öğretmenler bilgi bitki işlemleri, yapıları ve işlevleri ile nişan bitki Bilimleri Araştırma (bitki Bilim)
Birleşik Sates Department of Education tarafından (CFDA numarası 84.367B) ödül fonları
Yazarlar Dr Nian Wang Florida Üniversitesi genomik DNA örnekleri sunan için teşekkür etmek istiyorum Citrus sinensis Valencia bulaşmış.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
