Specifikke og præcise påvisning af Citrus grønnere patogen blev liberibacter spp. ved hjælp af konventionelle PCR på Citrus blad vævsprøver
Summary
Citrus grønnere er en særligt ødelæggende sygdom, der påvirker citrus afgrøder globalt. Præsenteres her er en simpel metode ved hjælp af PCR og genomisk DNA-ekstraktion af citrus blad væv for en nøjagtig og præcis identifikation af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp.
Abstract
Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, er en destruktiv citrus sygdom hærger citrus gårde globalt. Denne sygdom forårsager asymmetrisk gule blade mottling, vene gulfarvning, bladtab, root forfald, og i sidste ende, død den citrusfrugt. Når smittet, citrus planter har hæmmet i deres vækst og producere blomster uden for sæsonen. Disse blomster give sjældent frugt, og dem, der giver lille, bitter, uregelmæssigt formet citrus frugter der er ikke ønskeligt. Denne sygdom spredes af den asiatiske citrus psyllid, Diaphorina citri, og ved podning af inficeret citrus væv. Patogenet har en lang og variable inkubationstid inden for den citrusfrugt — undertiden år, inden der optræder symptomer. Forsøg på at kultur dette patogen in vitro- har været forgæves, muligvis på grund af lave og ujævn koncentration af patogenet inden for inficeret citrus væv, eller fordi det er svært at kopiere de miljømæssige betingelser, der fremmer vækst af patogenet. Det er meget vanskeligt at identificere sygdommen, før den har spredt sig, på grund af dens lang inkubationstid og forskernes evne til at kultur patogenet. Som et resultat, bliver sygdommen kun tilsyneladende efter pludselig ødelægge en citrus landmand hele udbyttet. Præsenteres her er en metode til præcis og specifik påvisning af citrus grønnere patogen, blev liberibacter spp. ved hjælp af en genomisk DNA udvinding kit og PCR. Denne metode er enkle, effektive, omkostningseffektive og kan tilpasses til kvantitativ analyse. Denne metode kan tilpasses til brug på alle citrus væv; Men, det er potentielt begrænset af mængden af patogenet stede i vævet. Ikke desto mindre, denne metode vil tillade citrus landmænd til at identificere inficerede citrus planter tidligere, og bremse spredningen af denne ødelæggende sygdom, før det kan yderligere spredning.
Introduction
Citrus grønnere, også kendt som huanglongbing, har forårsaget betydelige tab af citrus træer. Et repræsentativt tilfælde er Florida, hvor sygdommen er budgetteret til at forårsage en 70% reduktion i produktionen af Florida orange kasser fra 244 millioner kasser i sæsonen 1997-1998 til 70 millioner kasser fra 2016-2017 sæson1. 90% af citrus træer i Florida er over inficerede2, og det anslås, at Florida citrus industrien mister omkring 1 milliard dollars hvert år på grund af citrus sygdomme, hvori citrus grønnere spiller en stor rolle3. Citrus grønnere spredes primært af de invasive asiatiske citrus psyllid Diaphorina citri, men kan også spredes ved podning af inficeret væv. Sygdommen forårsager gulfarvning af venerne, asymmetrisk gule blade mottling, tidlig bladtab, kvist dieback, root forfald og død af anlægget. Vigtigere, medfører sygdommen citrusfrugt at producere blomster uden for sæsonen, som sjældent producerer frugt. Den frugt, der er produceret af inficerede citrus planter er umodne, grønne og bitter smag4.
Formålet med denne metode er at nøjagtigt og at identificere præcist motile bakterien blev liberibacter spp., det agens af citrus grønnere, bor i phloem inficerede citrustræer5. Genomisk DNA er udvundet fra hele blade væv, som indeholder de levende bakterier. Denne udpakkede genomisk DNA bruges som skabelon for konventionelle PCR, hvor oligonukleotider supplerer den bakterie 16S rDNA sekvens er brugt til at forstærke denne sekvens. Oligonukleotider supplerer en citrus FBOX gen anvendes som en indre forstærkning kontrol. Vi har valgt at bruge denne metode, fordi det har vist sig for at være vellykket i tidligere forskning6.
Denne metode har den klare fordel, at enkel, relativt billig og kan udføres i et normalt udstyret biokemi laboratorium. Derudover forbliver PCR den mest nøjagtige og præcise metode til påvisning af dette patogen, på grund af vanskeligheden ved dyrkning af dette patogen7og patogenets evne til at overleve og reproducere i år inden for en asymptomatisk vært8. Mange forskellige speciale PCR assays har været vant til med succes afsløre dette patogen; konventionelle PCR forbliver dog den enkleste assay for præcis og specifik påvisning, især inden for asymptomatiske værter8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er afgørende, at alle trin er fulgt nøjagtigt for at opnå optimal forsøgsbetingelser. Hele blade væv blev brugt under denne demonstration; protokollen kan dog ændres til teoretisk omfatter enhver form for plantevæv. Tidligere har forskere udvundet genomisk DNA fra blad vene væv, snarere end hele blade væv, og opnåede lignende resultater11. Hvis bandet svarende til citrus FBOX -genet udebliver, resultatet er ugyldig, og der kan være en eller flere af flere tekniske fejl i de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Konceptualisering, H.C. og Z. Q. F.; Undersøgelsen, H. C., J. C og Z. Q. F; Ressourcer, Z. Q. F.; Skrive – oprindelige udkast, I. A. P.; Skrivning – revision & redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. og Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tilsyn, Z. Q. F.; Finansiering erhvervelse, Z. Q. F og F. Q. L.
Projektet støttes af South Carolina forbedre lærer kvalitet videregående uddannelse staten tilskud med titlen, øge midterste kvaliteter Science Teachers’ viden af plante processer, strukturer og funktioner gennem Engagement i anlægget Sciences Research (Plant Videnskab)
Midlerne uddeles af den Forenede fratrak Department of Education (CFDA-nummer 84.367B)
Forfatterne vil gerne takke Dr. Nian Wang af University of Florida for at levere genomisk DNA-prøver fra inficeret Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
