Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben
Summary
Citrus Greening ist eine besonders destruktive Erkrankung Zitrusfrüchte Kulturen weltweit. Hier ist eine einfache Methode PCR und genomische DNA-Extraktion von Zitrusfrüchten Blattgewebe für die genaue und präzise Identifikation des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. verwenden
Abstract
Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, ist eine zerstörerische Zitrus Krankheit verwüsten Zitrusfrucht Betriebe weltweit. Diese Krankheit verursacht asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, Vene Vergilbung, entblätterung, Wurzel Verfall und letztlich der Tod der Zitrusfrüchte Pflanze. Wenn infiziert, die Zitruspflanzen haben Wachstumsstörungen und Blumen außerhalb der Saison zu produzieren. Diese Blumen bringen selten Obst, und diejenigen, die kleine, bitter, unregelmäßig geformte Zitrusfrüchte, die nachgeben sind nicht erwünscht. Diese Krankheit ist durch die asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, und durch die Pfropfung von infizierten Zitrusfrüchten Gewebe verteilt. Der Erreger hat eine lange und Variable Inkubationszeit innerhalb der Zitrusfrüchte Pflanze – manchmal Jahre, bevor Symptome auftreten. Versuche, dieses Erregers in Vitro Kultur unterlegen, möglicherweise aufgrund der geringen und unebenen Konzentration des Erregers innerhalb von Zitrusfrüchten Gewebe infiziert, oder weil es schwierig ist, die Umwelt zu replizieren Bedingungen förderlich für Wachstum der der Erreger. Es ist sehr schwierig, die Krankheit zu identifizieren, bevor es sich ausgebreitet hat, aufgrund seiner langen Inkubationszeit und Forscher Unfähigkeit zur Kultur des Erregers. Dadurch zeigt sich die Krankheit erst nach der Zerstörung plötzlich ein Zitrus Bauer gesamte Ausbeute. Hier ist eine Methode für die genaue und spezifische Erkennung des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. mit einem genomische DNA-Extraktion Kit und PCR. Diese Methode ist einfach, effizient, kostengünstig und flexibel für die Quantitative Analyse. Diese Methode kann für den Einsatz auf jedem Zitrus Gewebe angepasst werden; jedoch wird es möglicherweise durch die Menge der Erreger im Gewebe vorhanden begrenzt. Allerdings wird diese Methode zulassen, dass Zitrusfrüchte Landwirte infizierten Zitruspflanzen früher zu identifizieren und die Ausbreitung dieser zerstörerischen Krankheit einzudämmen, bevor sie weiter verbreiten kann.
Introduction
Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, hat einen bedeutenden Verlust von Zitrusbäumen verursacht. Ein repräsentativer Fall ist Florida, wo die Krankheit voraussichtlich eine Ermäßigung von 70 % in der Produktion von Florida orange-Boxen von 244 Millionen Kisten in der Saison 1997-1998 70 Millionen Kisten ab 2016-2017 Staffel1zufügen. Über 90 % der Zitrusbäume in Florida sind infizierte2, und es wird geschätzt, dass der Zitrusindustrie Florida etwa 1 Milliarde Dollar pro Jahr wegen Zitrusfrüchten Krankheiten verliert wobei citrus Greening eine wichtige Rolle-3 spielt. Citrus Greening wird in erster Linie durch die invasive asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, verbreitet aber auch durch Pfropfung des infizierten Gewebes. verteilt werden können Die Krankheit verursacht Gelbfärbung der Venen, asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, vorzeitige entblätterung, Zweig absterben, Wurzel Verfall und Tod der Pflanze. Wichtig ist, verursacht die Krankheit die Zitrusfrüchte Pflanze Blumen in der Nebensaison zu produzieren, die nur selten Früchte zu produzieren. Die Frucht, die durch infizierte Zitruspflanzen entsteht sind unreif, grün und bitter schmecken4.
Der Zweck dieser Methode ist es, genau und bewegliche Bakterium Verbindung Liberibacter spp., dem Erreger der citrus Greening, Leben in das Phloem von infizierten Zitrusbäume5genau zu bestimmen. Genomischer DNA entzogen ganze Blattgewebe, die Leben Bakterien enthält. Diese extrahierte genomische DNA dient als Vorlage für konventionelle PCR wo Oligonukleotide ergänzen das Bakterium 16 s rDNA Sequenz verwendet werden, um diese Sequenz zu verstärken. Oligonukleotide, die komplementär zu einem Zitrus FBOX gen dienen als eine interne Amplifikationskontrolle. Wir haben diese Methode verwenden, weil es nachweislich um in der bisherigen Forschung6erfolgreich zu sein.
Diese Methode hat den klaren Vorteil, einfach, kostengünstig und in der Lage, in jedem normal ausgestatteten Biochemie Labor durchgeführt werden. Darüber hinaus bleibt die PCR die genaue und präzise Methode zur Erkennung von dieser Erreger, wegen der Schwierigkeit der Kultivierung dieser Erreger-7und der Erreger Fähigkeit zu überleben und sich fortzupflanzen, seit Jahren im Rahmen einer asymptomatischen Host-8. Viele andere Spezialität-PCR-Assays wurden verwendet, um erfolgreich diese Erreger erkennen; konventionelle PCR bleibt jedoch der einfachste Test für präzise und spezifische Erkennung, vor allem innerhalb von asymptomatischen Gastgeber8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist wichtig, dass alle Schritte befolgt werden, genau um optimale Versuchsbedingungen zu erreichen. Ganze Blattgewebe diente während dieser Demonstration; das Protokoll kann theoretisch jede Art von Pflanzengewebe enthalten angepasst werden. Bisher haben Forscher Vene Blattgewebe, anstatt ganze Blattgewebe genomischen DNA entzogen und ähnliche Ergebnisse11erreicht. Wenn die Band das citrus FBOX -gen entsprechend nicht angezeigt wird, das Ergebnis ist ungültig, und möglicherweise ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Konzeption, H.C. und Z. f. F.; Untersuchung, H. C., J. C und Z. f. F; Ressourcen, Z. f. F.; Schreiben – Originalentwurf, I. A. P.; Schreiben – Review & Bearbeitung, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. und Z. f. F.; Visualisierung, H. C.; Aufsicht, Z. f. F.; Finanzierung Erwerb, Z. f. F und F. f. L.
Projekt unterstützt durch einen South Carolina Verbesserung Lehrer Qualität Hochschulbildung staatlichen Zuschuss mit dem Titel, Verbesserung der mittleren Klasse Science Teachers Wissen der Anlagenprozesse, Strukturen und Funktionen durch Engagement in Plant Sciences Research (Anlage Wissenschaft)
Mittel durch die Vereinigte Staaten Department of Education (CFDA-Nummer 84.367B)
Die Autoren möchte Dr. Nian Wang von der University of Florida für die Bereitstellung von genomischer DNA-Proben von Citrus Sinensis Valencia infiziert.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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