本文介绍了一种快速 CRISPR/Cas9-mediated 基因在小鼠和人原发性造血细胞中的破坏的协议。Cas9-sgRNA ribonucleoproteins 是通过电穿孔与 sgRNAs 产生通过体外转录和商业 Cas9。在有限的时间和财务成本下实现了高编辑效率。
在造血干细胞 (HSCs) 领域的研究进展得到了基因上的原代祖细胞和动物模型等方法的辅助。完整的基因消融在 HSCs 需要产生的剔除小鼠, HSCs 可以被隔离, 和基因消融在初级人类 HSCs 是不可能的。病毒转导可用于击倒的方法, 但这些都是由可变的功效。一般而言, 人类和小鼠造血细胞的基因操纵受到效率低下和时间和成本承诺的影响。最近, CRISPR/Cas9 极大地扩大了对哺乳动物细胞 DNA 的设计能力。然而, CRISPR/Cas9 在造血细胞中的应用具有挑战性, 主要是由于它们的转染效率低、质粒化方法的毒性以及基于病毒的协议的缓慢周转时间。
本文提供了一种快速的方法来执行 CRISPR/Cas9-mediated 基因编辑的小鼠和人造血干细胞和祖细胞的淘汰赛效率高达90%。这种方法采用了 ribonucleoprotein (RNP) 交付策略, 并简化了三天的工作流。使用 Cas9-sgRNA RNP 允许一个命中和运行的方法, 不引入外源 DNA 序列的基因组编辑细胞和减少目标的影响。基于 RNP 的方法是快速和直接的: 它不需要克隆 sgRNAs, 病毒制备或特定的 sgRNA 化学修饰。通过这项协议, 科学家们应该能够在一周内成功地生成一个人对原发性造血细胞感兴趣的基因的挖空, 包括对寡核苷酸合成的停机时间。此方法将允许更广泛的用户组根据需要调整此协议。
CRISPR/Cas9 的出现从根本上简化了哺乳动物细胞的基因编辑。早期的 CRISPR/Cas9 协议利用质粒或基于病毒的 Cas9 蛋白传递和 sgRNA1,2,3。这些方法在细胞和动物模型的发展中被证明是革命性的, 并且也成功地应用于原发性造血干细胞和祖细胞 (HSPCs)4,5。然而, 这些方法有许多缺点。首先, 基因中断效率通常仍然低于 50%4,5。虽然这足以在细胞系中产生挖空 (高) 无性系, 但短期文化的必要性使得 HSPCs 不适合这样的策略。其次, 克隆的要求限制了可以在单个实验中测试的 sgRNAs 量, 并生成大而难染的构造。第三, 这些方法迫使科学家放慢周转时间。
为了克服这些限制, 我们的小组在 HSPCs 使用基于 Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs) 的交付6开发并最近发布了一种替代 CRISPR/Cas9 方法。在这个策略中, CRISPR (Cas9 蛋白和体外转录 sgRNA) 的原始成分是预复杂的, 通过电穿孔直接传递到目标细胞 (图 1)。由于 Cas9-sgRNA RNP 复合体的半衰期比转录质粒或病毒核酸的时间短, 与早期方法7相比, 离靶速率较低。此外, RNP 方法增加了消除任何外源 DNA 来源的好处, 它可以随机整合到目标细胞基因组, 导致细胞转化。
该协议是基于基于 RNP 的基因中断实验的简化工作流, 如图 1所示。第一步是为每个 sgRNA 设计和订购底漆。这些引物用于制作 sgRNA DNA 模板, 用于体外转录 (IVT) 以获得 sgRNAs。纯化后的 sgRNAs 与以前购买的 Cas9 蛋白一起孵化, 形成 Cas9-sgRNA RNP 复合物。最后, 将预复合 Cas9-sgRNA RNPs 转成细胞。在电穿孔后, 可以对编辑效率进行测试, 并根据需要对体外/体内实验进行启动。下面对这个创新的实验方法的详细描述可以找到。
本详细协议中描述的 RNP 方法能够有效地在小鼠和人的原发性造血细胞以及悬浮细胞系中进行基因剔除。虽然经常获得高的效率, 但需要考虑几个关键变量。首先, 正确的外显子选择是保证有效的 indel 合并对应于基因敲除的关键。与外显子选择相关的两个重要因素是在转录中跨亚型和外显子位置的守恒。异构体表达式模式是跨单元格类型的变量, 因此, 如果需要跨单元格类型的基因高, 则应针对单元格类型之间不变的外显子。异构体模式可以通过 q PCR 或 RNA 测序数据来验证。对于在成绩单内的外显子位置, 最好是针对早期外显子, 因为 frameshift 突变在终端或倒数第二外显子可能逃脱废话介导的衰变10, 产生的蛋白质具有新颖或未知的功能, 而不是真正的空。
确定 indel 频率是评估高效率和正确解释实验生物学结果的关键步骤。内切酶化验 (如验船师化验) 具有相对快速和易于执行的优点。然而, 它们往往是不准确的, 由于重要的背景信号和结果往往难以重现。此外, 他们也没有提供关于实验中产生的 indels 质量 (例如插入和删除长度) 的信息。限制性的测序提供了一个宝贵的替代方法。诸如潮汐11 (https://tide.nki.nl/) 这样的平台有助于分解的痕迹, 并能准确估计出等位基因的干扰效率, 同时也提供了个体 indels 的频率。主要的缺点是绝对依赖高质量的桑格测序跟踪。高通量扩增子排序克服了大多数这些问题。扩增子库可以从非常低的 DNA 输入开始准备, 高覆盖率确保了可靠的结果。为了降低扩增子测序的成本, 我们通常只使用 1-1.5% 的总读数, 将扩增子库调成更大的顺序运行 (如 RNA 排序)。最后, 为了确认成功的淘汰赛, 我们强烈建议在可能的情况下, 通过西方印迹或流式细胞术评估蛋白质水平。
如前所述, 这里提出的方法是快速和直接的, 代表了一个新的工具来研究基因敲出老鼠和人类 HSPCs。虽然我们的协议提供了使用尖端电穿孔系统进行基因挖空的指令, 但其他系统已经被证明是高效的12,13。
在 RNP 方法方面需要承认两个主要的限制。首先, 正如我们小组所描述的, HSPCs 转与体外转录 sgRNAs 的生存能力可以通过电穿孔显著地损害, 特别是当条件不是最佳6时。如果需要, 商业合成的 sgRNAs (即消除体外转录) 可能会克服这个问题。随着时间的推移, 这些成本越来越低, 可以从几家供应商那里购买。在这种情况下,体外转录可用于生成 sgRNA 的池以进行有效性筛选, 然后可以选择最有效的 sgRNA 进行合成。RNP 方法的第二个主要限制是无法追踪成功转染的细胞, 如在基于病毒的方法中。然而, 在许多实验场景中, Cas9-sgRNA RNPs 获得的高高效率和快速编辑可能会超过这些缺点。我们建议使用高通量的扩增子测序来精确确定每个实验的中断效率。如果预期基因的剔除会赋予增生表型 (即与野生型细胞相比减少或增加增殖), 那么在多个时间点确定 indel 频率可以评估高细胞是否经过浓缩 (即 indel 频率随时间增加) 或 outcompeted (i. e. indel 频率随时间而减少)。
执行体内或体外实验来了解基因功能丧失的生物学效应需要适当的控制。如前所述,体外转录 sgRNAs 可能对细胞有毒, 特别是主要祖细胞6。此外, Cas9 蛋白引起的 DNA 双链断裂可引起基因独立的抗增生反应14。因此, 我们经常在 CRISPR 实验中使用一些控制 sgRNAs, 并推荐在您的细胞类型上表达的细胞表面标记以及未表达的第二个目标基因。
在细胞因子存在的情况下, 人类 HSPCs 的短期培养提高了基因破坏效率6 , 是实现高效高的必要条件。在电穿孔6之前, 我们发现 36-48 小时是文化的理想时期。随着电穿孔, 细胞可以进一步培养, 记住, 越长的文化越高的风险, 失去多向植入能力。因此, 我们通常在电穿孔后6小时进行移植, 并且在电穿孔后不超过24小时。
CRISPR/Cas9 极大地提高了科学家成功编辑哺乳动物细胞基因组的能力。预测在原代造血祖细胞中基因破坏更可行, 可以快速提高 HSPCs 和血液病领域的科学知识。重要的是, 这里描述的协议使它也可以同时产生多个挖空高效率, 允许建模复杂的遗传景观, 往往见于白血病疾病。
虽然本文所描述的协议的重点是基因中断, 它们可能很容易适应基因敲入实验。这可以通过联合交付单链寡核苷酸模板进行同源定向修复6、13 (HDR) 或通过电穿孔后的细胞转导, AAV6 向量包含同源模板12。在 HSPCs 中修复或引入特定突变的能力将促进基因治疗的新的治疗策略, 以及在反洗钱和其他血液疾病中癌症驱动因子突变的扩大研究。虽然人类 HSPCs 中的 HDR 已成功6、12、13, 但使用此策略6很难编辑鼠标 HSPCs。优化人类中的 HDR 协议, 特别是在鼠标 HSPCs 中, 将能够更具体地编辑和开发工具, 以便使用内源标记跟踪编辑过的单元格。
最后, 还有一种设想是, 突变的功能性等位基因的中断可能是先天性和后天造血疾病的潜在治疗方法。在这种情况下, 建议采用无 DNA 的方法, 以避免可能的集成, 从而促进转化。此外, “命中和运行” 方法减少了不想要的非目标效果的可能性。需要作出更多的努力, 以发展具体的运载系统, 为治疗恶性和非恶性血液病开辟新的途径。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到得克萨斯州癌症预防和研究所 (RP160283、RP140001 和 R1201) 的支持, 加布里埃尔的癌症研究天使基金会, 爱德华. 埃文斯基金会和 NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752,CA193235 和 DK107413)。M.C.G. 是由贝勒研究倡导者支持的学生科学家。流式细胞术由 NIH (国家研究资源赠款 S10RR024574、国家过敏和传染性疾病研究所 AI036211 和国立癌症研究所 P30CA125123) 部分支持贝勒医学院细胞分选核心。
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |