Generering af transgene planter med enkelt-kopi indrykninger ved hjælp af BIBAC-GW binære vektor
Summary
Ved hjælp af en pBIBAC-GW binære vektor gør skabe transgene planter med intakt enkelt-kopi indsættelser, en nem proces. Her, præsenteres en række protokoller som guide læseren gennem processen med at generere gensplejsede Arabidopsis planter, og test planter til handelsformer, og kopierer antallet af indsætter.
Abstract
Når du genererer transgene planter, generelt er målet at have stabile udtryk for en transgen. Dette kræver en enkelt, intakt integration af transgenet, som multi kopi integrationer udsættes ofte for genhæmning. Gateway-kompatible binære vektor baseret på bakteriel kunstige kromosomer (pBIBAC-GW), ligesom andre pBIBAC derivater, giver mulighed for isætning af enkelt-kopi transgener med høj effektivitet. Som en forbedring af den oprindelige pBIBAC, er en Gateway kassette blevet klonet i pBIBAC-GW, så at sekvenser af interesse kan nu let integreres i vektor overførsel DNA (T-DNA) af Gateway kloning. Almindeligt, transformation med pBIBAC-GW resulterer i en effektivitet på 0,2-0,5%, hvorved halvdelen af transgenics bære en intakt enkelt-kopi integration af T-DNA. PBIBAC-GW vektorer fås med resistens over for ammoniumglufosinat eller DsRed fluorescens i frø frakker til udvalg i planter og modstand mod kanamycin som en markering i bakterier. Her, en række protokoller er præsenteret som guide læseren gennem processen til oprettelse af transgene planter ved hjælp af pBIBAC-GW: start fra rekombinerer sekvenser af interesse i pBIBAC-GW vektor af valg, at plante transformation med Agrobacterium, udvalg af transgenics, og test planter til handelsformer og kopier række indsætter ved hjælp af DNA blotting. Opmærksomhed er givet til at designe en DNA blotting strategi at genkende single og multi kopi integrationer på enkelt- og flersidede loci.
Introduction
Når du genererer transgene planter, er normalt målet at have integreret transgeners stabilt udtrykt. Dette kan opnås ved intakt enkelt kopi integrationer af en transgenet. Flere integrationer kan føre til øget udtryk for en transgen, men også til genhæmning. Hæmning af transgener er mere sandsynlige, hvis indsatte sekvenser er arrangeret i tandem eller omvendt gentagelser1,2,3,4. Binære vektorer bruges som transport i Agrobacterium-medieret transformation eksperimenter for at levere sekvenser af interesse i anlægget genomer. Antallet af integrationer i en plante genom er afhængig af kopi antallet af den binære vektor i Agrobacterium tumefaciens5,6. Mange almindeligt anvendte binær vektorer er høj kopi vektorer, og derfor give en høj gennemsnitlig transgen kopi nummer: 3.3 til 4,9 eksemplarer i Arabidopsis5.
Antallet af T-DNA integrationer kan sænkes ved hjælp af binær vektorer, der har en lav-kopi nummer i A. tumefaciens, såsom BIBAC7, eller ved at lancere en T-DNA fra A. tumefaciens kromosom5. Det gennemsnitlige antal af transgenet integrationer i sådanne tilfælde er under 25,8,9,10. På grund af er enkelt-kopi i A. tumefaciens, og også i Escherichia coli, BIBAC-derivater kan vedligeholde og levere konstruktioner så stor som 150 kb11.
GW-kompatible BIBAC vektorer10,12 tillader nem indførelsen af gener af interesse vektor bruger Gateway kloning. Brugen af Gateway teknologi forenkler proceduren for kloning, men også overvinder almindelige problemer i forbindelse med store lav-kopi-nummer vektorer13,14, såsom et lavt DNA udbytte og et begrænset udvalg af unikke begrænsning sites tilgængelige for kloning7,11. PBIBAC-GW derivater er tilgængelige med enten resistens over for ammoniumglufosinat (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frø frakker (pBIBAC-RFP-GW) for udvalg i planter (figur 1)10,12. For begge vektorer bruges et kanamycin resistens gen som udvalg markør i bakterier.
PBIBAC-GW vektorer kombinere: (1) let design og genmanipulation i E. coli, (2) intakt enkelt-kopi integrationer og planta på høj effektivitet. PBIBAC-GW vektorer udbytte på gennemsnit 1,7 integrationer i Arabidopsis med ca. halvdelen af de transgene planter bærer en enkelt integreret T-DNA10.
Stabil udtryk af transgener er et krav for de fleste transgenics genereret. Stabil transgen udtryk kan opnås ved intakt, enkelt-kopi integrationer. Arbejde med transgene planter bærer intakt, enkelt-kopi integrationer er imidlertid endnu vigtigere, hvis for eksempel, formålet er at undersøge effektiviteten af kromatin-baserede processer, såsom mutagenese, rekombination, eller reparation og afhængighed af disse processer på lokationen genomisk og kromatin struktur på indsættelsesstedet. For vores interesse for at studere afhængighed af oligonukleotid instrueret mutagenese (ODM) på den lokale genomiske kontekst, blev et sæt reporter linjer med intakt, enkelt-kopi integrationer af en mutagenese reporter gen genereret (figur 2)10. Bruger dette sæt af linjer, blev det vist, at ODM effektivitet varierer mellem transgene loci integreret på forskellige genomisk steder, trods de transgene udtryk niveauer er temmelig lignende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritisk til at generere transgenics med enkelt, intakt integrationer af en transgen er valget af den binære vektor, der anvendes. BIBAC familie vektorer har været brugt til at levere sekvenser af interesser mange plante arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, herunder BIBAC-GW, give enkelt-kopi integrationer med høj effekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er støttet af den hollandske teknologi Foundation STW (12385), som er en del af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO), og som er delvis finansieret af Ministeriet for økonomiske anliggender (OTP Grant 12385 til MS). Vi takker Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) for at give pCH20, rygraden i BIBAC-GW vektorer.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
