Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW
Summary
Un vecteur binaire pBIBAC-GW permet de générer des plantes transgéniques avec insertions de simple copie intactes, un processus facile. Une série de protocoles est présentée ici, qui guide le lecteur à travers le processus de génération des plantes transgéniques d’Arabidopsis et tester les plantes pour l’intégrité et de copier le nombre des plaquettes.
Abstract
Lors de la génération de plantes transgéniques, en général, l’objectif est d’avoir une expression stable d’un transgène. Cela nécessite une intégration unique et intacte du transgène, copies plusieurs intégrations sont souvent victimes de silençage génique. Le vecteur binaire compatible Gateway basé sur les chromosomes artificiels bactériens (pBIBAC-GW), comme les autres dérivés de pBIBAC, permet l’insertion de transgènes exemplaire unique avec une grande efficacité. Comme une amélioration à le pBIBAC originale, une cassette de passerelle a été clonée en pBIBAC-GW, afin que les séquences d’intérêt peuvent maintenant être facilement incorporés dans l’ADN (ADN-T) de transfert de vecteur par clonage Gateway. Communément, la transformation avec pBIBAC-GW se traduit par une efficacité de 0,2 – 0,5 %, selon laquelle la moitié de la transgénèse portent une intégration simple copie intacte de l’ADN-T. Les vecteurs pBIBAC-GW sont disponibles avec résistance au Glufosinate-ammonium ou DsRed fluorescence dans les téguments de sélection dans les plantes et résistance à la kanamycine comme une sélection chez les bactéries. Ici, une série de protocoles est présentée qui guident le lecteur à travers le processus de génération de plantes transgéniques à l’aide de pBIBAC-GW : à partir de recombiner les séquences d’intérêt dans le vecteur pBIBAC-GW de choix, de planter la transformation avec Agrobacterium, sélection de la transgénèse et tester les plantes pour intact et copie le numéro des inserts utilisant l’ADN buvard. Attention est accordée à la conception d’une stratégie de transfert de l’ADN de reconnaître single – et multi – multicopies intégrations à locus unique et multiple.
Introduction
Lors de la génération de plantes transgéniques, généralement l’objectif est d’avoir les transgènes intégrés exprimée de façon stable. Ceci peut être réalisé par intégrations exemplaire intact d’un transgène. Plusieurs intégrations peuvent conduire à une augmentation de l’expression d’un transgène, mais aussi de silençage génique. Silencieux d’échappement de transgènes est plus probable si les séquences insérées sont disposées en tandem ou des séquences inversées répétées1,2,3,4. Vecteurs binaires servent de navettes à Agrobacterium-médiée par des expériences de transformation pour livrer les séquences d’intérêt dans les génomes de plantes. Le nombre d’intégrations dans un génome végétal dépend du nombre de copies du vecteur binaire à Agrobacterium tumefaciens5,6. Beaucoup de vecteurs binaires couramment utilisés sont des vecteurs d’élevé de copies et donnent donc un nombre de copies de transgènes moyenne haute : copies de 3,3 à 4,9 dans Arabidopsis5.
Le nombre d’intégrations de l’ADN-T peut être abaissé à l’aide de vecteurs binaires qui ont un certain nombre de faibles copies dans a. tumefaciens, tels que BIBAC7, ou en lançant un ADN-T de l’a. tumefaciens du chromosome5. Le nombre moyen d’intégrations de transgene dans de tels cas est inférieur à 25,8,9,10. Car elle a été exemplaire unique dans a. tumefaciens et aussi chez Escherichia coli, BIBAC-dérivés peuvent maintenir et livrer des constructions plus grandes que 150 Ko,11.
GW-compatible BIBAC vecteurs10,12 permettre une introduction facile des gènes d’intérêt dans le vecteur à l’aide de clonage Gateway. L’utilisation de la technologie de passerelle qui simplifie grandement la procédure de clonage, mais aussi permet de surmonter les problèmes communs associés à13,grands vecteurs de basse-copie-numéro14, comme un faible rendement de l’ADN et une sélection limitée de restriction uniques sites disponibles pour le clonage de7,11. Les dérivés pBIBAC-GW sont disponibles avec une résistance au Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescence dans les téguments (pBIBAC-DP-GW) de sélection dans les végétaux (Figure 1)10,12. Pour les deux vecteurs, un gène de résistance kanamycine est utilisé comme marqueur de sélection chez les bactéries.
Combinent les vecteurs pBIBAC-GW : (1) simplifie la conception et la manipulation génétique chez e. coliet (2) intact simple copie intégrations en planta à haute efficacité. Le rendement des vecteurs pBIBAC-GW intégrations moyenne 1,7 chez Arabidopsis avec environ la moitié des plantes transgéniques portant un seul intégré l’ADN-T10.
L’expression stable de transgènes est une exigence pour la plupart transgéniques générées. Expression du transgène stable est possible par des intégrations intactes, exemplaire unique. Toutefois, travailler avec des plantes transgéniques porteuses intégrations intactes, exemplaire unique est encore plus important si, par exemple, le but est d’étudier l’efficacité des processus axés sur la chromatine, tels que la mutagénèse, recombinaison, ou la réparation et la dépendance à l’égard de ces processus sur l’emplacement de la génomique et la structure de la chromatine au site d’insertion. Pour notre intérêt, pour étudier la dépendance de la mutagénèse oligonucléotide réalisé (ODM) sur le contexte local de génomique, un ensemble de lignes de journaliste avec des intégrations intacts, de la simple copie d’un gène rapporteur de mutagenèse a été généré (Figure 2)10. À l’aide de cet ensemble de lignes, il a été démontré que l’efficacité de l’ODM varie entre locus transgéniques intégrés à différents endroits de génomiques, malgré les niveaux d’expression de transgènes plutôt semblables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Critique pour générer des organismes transgéniques avec des intégrations unique et intactes d’un transgène est le choix du vecteur binaire utilisé. Vecteurs de famille BIBAC ont été utilisés pour livrer les séquences des intérêts de nombreuses plantes espèces23,24,25,26,27,28. Vecteurs BIBAC, y compris BIBAC-GW…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par le hollandais STW Foundation Technology (12385), qui fait partie de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), et qui est financé en partie par le ministère des affaires économiques (OTP Grant 12385 à MS). Nous remercions Carol M. Hamilton (Cornell University, Etats-Unis) pour la fourniture de pCH20, l’épine dorsale des vecteurs BIBAC-GW.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
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