BIBAC-गिनीकृमि द्विआधारी वेक्टर का उपयोग एकल-प्रतिलिपि सम्मिलन के साथ ट्रांसजेनिक संयंत्रों का सृजन
Summary
एक pBIBAC-गिनीकृमि द्विआधारी वेक्टर का प्रयोग बरकरार एकल प्रतिलिपि निवेशन, एक आसान प्रक्रिया के साथ ट्रांसजेनिक संयंत्रों पैदा करता है । यहां, प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की है कि ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्रों पैदा करने की प्रक्रिया के माध्यम से पाठक गाइड, और अक्षुण्णता और आवेषण के प्रति संख्या के लिए पौधों का परीक्षण ।
Abstract
जब ट्रांसजेनिक पौधों पैदा, आम तौर पर उद्देश्य के लिए एक transgene के स्थिर अभिव्यक्ति है । यह transgene के एक एकल, बरकरार एकीकरण की आवश्यकता है, के रूप में बहु की नकल एकीकरण अक्सर जीन मुंह बंद करने के अधीन हैं । गेटवे-संगत बाइनरी वेक्टर अन्य pBIBAC डेरिवेटिव्स की तरह बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (pBIBAC-गिनीकृमि) के आधार पर उच्च दक्षता के साथ एकल-प्रति transgenes के सम्मिलन की अनुमति देता है । मूल pBIBAC के लिए एक सुधार के रूप में, एक गेटवे कैसेट pBIBAC-गिनीकृमि में क्लोन किया गया है, ताकि ब्याज की जुगाड़ अब आसानी से गेटवे क्लोनिंग द्वारा वेक्टर स्थानांतरण डीएनए (टी डीएनए) में शामिल किया जा सकता है । सामांयतः, pBIBAC के साथ परिवर्तन-0.2 के एक दक्षता में गिनीकृमि परिणाम-0.5%, जिससे transgenics के आधा टी के एक बरकरार एकल प्रतिलिपि-डीएनए के एकीकरण ले । pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर पौधों में चयन के लिए बीज कोट में Glufosinate-अमोनियम या DsRed प्रतिदीप्ति प्रतिरोध के साथ उपलब्ध हैं, और बैक्टीरिया में एक चयन के रूप में कनमीसिन प्रतिरोध के साथ । यहां, प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की है कि ट्रांसजेनिक संयंत्रों pBIBAC-गिनीकृमि का उपयोग कर पैदा करने की प्रक्रिया के माध्यम से पाठक गाइड: pBIBAC-गिनीकृमि पसंद के सदिश में ब्याज के दृश्यों के संयोजन से शुरू, के साथ संयंत्र परिवर्तन के लिए एग्रोबेक्टीरियम, transgenics का चयन, और डीएनए सोख्ता का उपयोग कर आवेषण की अक्षुण्णता और प्रतिलिपि संख्या के लिए पौधों का परीक्षण. ध्यान एक डीएनए सोख्ता रणनीति डिजाइन करने के लिए एक और बहु loci पर एकल और मल्टी कॉपी एकीकरण को पहचानने के लिए दिया जाता है ।
Introduction
ट्रांसजेनिक पौधों पैदा करते हैं, आमतौर पर उद्देश्य के लिए एकीकृत transgene (एस) छुरा व्यक्त किया है । यह एक transgene के अक्षुण्ण एकल प्रतिलिपि एकीकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एकाधिक एकीकरण एक transgene की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन यह भी जीन मुंह बंद करने करने के लिए. transgenes के मुंह बंद करने अधिक संभावना है यदि संमिलित अनुक्रम मिलकर या उल्टे में व्यवस्था कर रहेहै1, 2, 3, 4 । बाइनरी वैक्टर एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन प्रयोगों में शटल के रूप में इस्तेमाल किया संयंत्र जीनोम में ब्याज की जुगाड़ देने के लिए कर रहे हैं । एक संयंत्र जीनोम में एकीकरण की संख्या एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens5,6में बाइनरी वेक्टर की प्रतिलिपि संख्या पर निर्भर है। कई सामांयतः इस्तेमाल किया द्विआधारी वैक्टर उच्च प्रतिलिपि वैक्टर हैं, और इसलिए एक उच्च औसत transgene कॉपी संख्या: 3.3 के लिए 4.9 प्रतियां Arabidopsis5में उपज ।
t-dna एकीकरणों की संख्या को बाइनरी वैक्टर का उपयोग करके कम किया जा सकता है जो a. tumefaciensमें एक कम-प्रतिलिपि संख्या है, जैसे BIBAC7, या a. tumefaciens गुणसूत्र5से एक T-dna लॉंच करके । ऐसे मामलों में transgene एकीकरणों की औसत संख्या 25,8,9,10से नीचे है । A. tumefaciens में एकल-प्रतिलिपि होने के कारण, और भी ई कोलाईमें, BIBAC-डेरिवेटिव बनाए रखने और 150 kb11के रूप में बड़े रूप में constructs वितरित कर सकते हैं ।
गिनीकृमि-संगत BIBAC वैक्टर10,12 में ब्याज की जीन का आसान परिचय की अनुमति गेटवे क्लोनिंग का उपयोग कर वेक्टर में । गेटवे प्रौद्योगिकी का उपयोग बहुत क्लोनिंग प्रक्रिया को सरल, लेकिन यह भी आम बड़ी कम कॉपी-संख्या वैक्टर13,14, जैसे एक कम डीएनए उपज और अद्वितीय प्रतिबंध के एक सीमित चयन के रूप में के साथ जुड़े समस्याओं पर काबू 7,11क्लोनिंग के लिए उपलब्ध साइटें । pBIBAC-गिनीकृमि डेरिवेटिव Glufosinate के लिए या तो प्रतिरोध के साथ उपलब्ध है-अमोनियम (pBIBAC-बार-गिनीकृमि) या बीज कोट में DsRed प्रतिदीप्ति (pBIBAC-आरएफपी-गिनीकृमि) पौधों में चयन के लिए (चित्रा 1)10,12। दोनों वैक्टर के लिए, एक कनमीसिन प्रतिरोध जीन बैक्टीरिया में चयन मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर गठबंधन: (1) आसान डिजाइन और ई. कोलाईमें आनुवंशिक हेरफेर, और (2) बरकरार एकल उच्च दक्षता पर planta में नकल एकीकरण । pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर एक एकल एकीकृत टी-डीएनए10ले जाने के ट्रांसजेनिक पौधों के लगभग आधे के साथ Arabidopsis में औसत 1.7 एकीकरण पर उपज ।
transgenes के स्थिर अभिव्यक्ति सबसे transgenics उत्पंन के लिए एक आवश्यकता है । स्थिर transgene अभिव्यक्ति अक्षुण्ण, एकल प्रतिलिपि एकीकरण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । ट्रांसजेनिक पौधों को बरकरार रखने के साथ कार्य करना, एकल-प्रतिलिपि एकीकरण है, तथापि, और भी अधिक महत्वपूर्ण यदि उदाहरण के लिए, उद्देश्य क्रोमेटिन आधारित प्रक्रियाओं की दक्षता का अध्ययन करने के लिए है, जैसे mutagenesis, पुनर्संयोजन, या मरंमत, और इन की निर्भरता संमिलन स्थल पर जीनोमिक स्थान और क्रोमेटिन संरचना पर कार्यवाई करता है । हमारे हित के लिए, स्थानीय जीनोमिक संदर्भ पर oligonucleotide निर्देशित mutagenesis (ODM) की निर्भरता का अध्ययन करने के लिए, बरकरार, एक mutagenesis रिपोर्टर जीन की एक प्रतिलिपि एकीकरण के साथ रिपोर्टर लाइनों का एक सेट उत्पन्न किया गया था (चित्रा 2)10. लाइनों के इस सेट का उपयोग करते हुए यह दिखाया गया है कि ODM दक्षता अलग जीनोमिक स्थानों पर एकीकृत ट्रांसजेनिक loci के बीच, transgene अभिव्यक्ति के बजाय समान होने के स्तर के बावजूद भिन्न होता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक transgene के एकल, बरकरार एकीकरण के साथ transgenics पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण द्विआधारी वेक्टर का चयन किया जाता है । BIBAC परिवार वैक्टर कई संयंत्र प्रजातियों23,24,25,26,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को डच प्रौद्योगिकी फाउंडेशन STW (१२३८५) द्वारा समर्थित है, जो नीदरलैंड के वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO) के लिए संगठन का हिस्सा है, और जो आंशिक रूप से आर्थिक मामलों के मंत्रालय (ओटीपी अनुदान १२३८५ से एमएस) द्वारा वित्त पोषित है । हम कैरोल एम हैमिल्टन (कॉर्नेल विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका) pCH20, BIBAC-गिनीकृमि वैक्टर की रीढ़ प्रदान करने के लिए धंयवाद ।
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
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