JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Published: May 04, 2018
doi:
10.3791/57298
, , , , , , ,
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology,Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics,Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Pseudomonas aeruginosa infectie veroorzaakt significante morbiditeit in kwetsbare hosts. De nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek van P. aeruginosa stam PA14, uitgeroepen tot PA14NR ingesteld, vergemakkelijkt de analyse van gene functionaliteit in tal van processen. Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van hoge kwaliteit kopieën van de PA14NR ingesteld mutant bibliotheek.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie alomtegenwoordig in de menselijke omgevingen. P. aeruginosa vermag vormen van biofilms, ontwikkelen van resistentie tegen antibiotica, produceren van virulentiefactoren en snel evolueren in de loop van een chronische infectie. Dus P. aeruginosa kan leiden tot zowel acute en chronische, moeilijk te behandelen van infecties, resulterend in significante morbiditeit in bepaalde patiënt populaties. P. aeruginosa stam PA14 is een menselijke klinische isolaat met een geconserveerde genoom structuur die een verscheidenheid aan zoogdieren en nonvertebrate gastheren maken PA14 een aantrekkelijke stam voor de studie van deze ziekteverwekker infecteert. In 2006, werd een nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek met 5,459 mutanten overeenkomt met 4,596 voorspelde PA14 genen geproduceerd. Sindsdien heeft de distributie van de bibliotheek PA14 de onderzoeksgemeenschap om beter te begrijpen de functie van afzonderlijke genen en complexe trajecten van P. aeruginosatoegestaan. Handhaving van de integriteit van de bibliotheek door middel van het replicatieproces vereist goede behandeling en precieze technieken. Te dien einde stelt dit manuscript protocollen die beschrijven in detail de stappen bij bibliotheek replicatie, de controle van de kwaliteit van de bibliotheek en correcte opslag van individuele mutanten betrokken.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie aanwezig in de bodem, water, en de meeste menselijke omgevingen, evenals huid microflora. Vergeleken bij veel bacteriesoorten, heeft P. aeruginosa een relatief grote genoom van 5.5-7 Mbp met hoge G + C inhoud (65-67%). Bovendien een aanzienlijk deel van de genen betrokken zijn bij de metabole aanpassingsvermogen en zijn onderdeel van regulerende netwerken, grote flexibiliteit in reactie op de milieudruk1. P. aeruginosa geeft uiting aan een overvloed van virulentiefactoren, neiging naar formulier biofilms vertoont, bezit het vermogen om te coördineren van de reacties via meerdere quorum sensing trajecten en bevat een opmerkelijke capaciteit te ontwikkelen resistentie tegen antibiotica en tolerantie2,3,4,5,6,7,8. Deze kenmerken stellen belangrijke uitdagingen voor de behandeling van infecties veroorzaakt door P. aeruginosa.

Chronische P. aeruginosa infecties kunnen optreden in talrijke ziekte staten. Cystic fibrosis (CF), een genetische ziekte die wordt veroorzaakt door mutatie van het gen Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) , resulteert in inspissated, besmette afscheidingen binnen de luchtwegen, progressieve Bronchiëctasie en uiteindelijk dood van respiratoire insufficiëntie9. Door volwassenheid, zijn de meerderheid van de patiënten met CF chronisch geïnfecteerd met P. aeruginosa, dat een sleutelrol in de morbiditeit en mortaliteit die zijn gekoppeld aan deze ziekte10 speelt. Bovendien hebben patiënten met ernstige branden verwondingen11, tracheostomies12, gewrichtsprothesen13of inwonende katheters14 risico op P. aeruginosa infectie gerelateerd aan van de bacteriën vermogen om vorm biofilms en ontsnappen host15van de inflammatoire reacties. Verder, kolonisatie zonder concurrentie treedt op nadat een bevolking meerdere antibiotica resistentie of tolerant is geselecteerd door middel van breedspectrum, sequentiële antimicrobiële behandeling12,16,17 , 18. beter begrijpen van de pathogenese van P. aeruginosa zal belangrijke gevolgen hebben voor talloze ziekte staten.

Verschillende P. aeruginosa klinische isolaten, met inbegrip van stammen PAO1, PA103, PA14 en PAK, zijn uitvoerig bestudeerd om te onderzoeken van de verschillende functies van P. aeruginosa pathogenese. Stam PA14 is een klinische isolaat die behoort tot een van de meest voorkomende klonale groepen wereldwijd19,20 en heeft niet uitgebreid in het laboratorium is gepasseerd. PA14is zeer virulente in gewervelde modellen van infectie, met een opmerkelijke endotoxine profile21, pili structuur22, pathogeniteit eilanden23, III secretie typesysteem (TTSS), cytotoxiciteit naar zoogdieren cellen24 en profielen van antibiotische weerstand en volharding25. Bovendien, PA14 is ook zeer virulente in talrijke gastheer-pathogeen modelsystemen, met inbegrip van plant blad infiltratie modellen26,27,Caenorhabditis elegans infectie modellen28, 29, insect modellen30,31, evenals muis longontsteking modellen32,,33 en huid branden modellen34.

Genoom-brede mutant bibliotheken zijn verzamelingen van isogene mutanten in niet-essentiële genen die zeer krachtige tools om te begrijpen van de biologie van een organisme door analyse van de genfunctie toe te staan op een genomic schaal vormen. Twee in de buurt van-saturation transposon invoeging mutant bibliotheken gebouwd in P. aeruginosa zijn momenteel beschikbaar voor distributie. De sites van de invoeging van de transposons zijn vastgesteld voor beide bibliotheken. Deze zogenaamde nonredundant bibliotheken genoom-brede studie van bacteriestammen vergemakkelijken door het aanzienlijk verlagen van de tijd en kosten genfunctieonderzoek screening willekeurige transposon mutanten. De P. aeruginosa PAO1 transposon mutant bibliotheek, gebouwd in de MPAO1 isoleren van de stam PAO1 met behulp van transposons ISphoA/ hah en ISlacZ/ hah35, is samengesteld door het Manoil laboratorium, Universiteit van Washington. De bibliotheek bestaat uit een reeks-geverifieerd verzameling 9,437 transposon mutanten die biedt brede genoom dekking en omvat twee mutanten voor de meeste genen36. Informatie over de PAO1 van de P. aeruginosa transposon mutant library is beschikbaar op de openbare, internet toegankelijke Manoil lab-website op http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek (PA14NR ingesteld) gebouwd in stam PA14 met behulp van de MAR2xT7 en Tn transposonsphoA37 wordt momenteel gedistribueerd door de afdeling kindergeneeskunde in het Massachusetts General Hospital. De PA14NR Set bestaat uit een verzameling van meer dan 5.800 mutanten met één transposon invoegingen in niet-essentiële genen37. Details over de bouw van de PA14NR Set zijn beschreven in de openbare, toegankelijke internet site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, waarin ook een scala aan online zoekprogramma’s om het gebruik van de PA14NR Instellen.

De oorspronkelijke PA14NR Set bestond uit 5,459 mutanten, geselecteerd uit een uitgebreide bibliotheek van ongeveer 34.000 willekeurige transposon insertiemutanten, die overeenkomen met 4,596 voorspelde PA14 genen 77% van alle voorspelde PA14 genen37. Sinds de bouw van de bibliotheek in 2006 nieuwe mutanten werden toegevoegd, en momenteel de PA14NR Set omvat meer dan 5.800 mutanten38 die vertegenwoordigen ongeveer 4.600 PA14 genen. De meerderheid van de PA14 transposon mutanten werden gegenereerd in het wild type achtergrond37. Details over elk lid van de mutant bibliotheek, met inbegrip van genetische achtergrond, zijn beschikbaar via de online database zoeken, of door het downloaden van de Nonredundant bibliotheek spreadsheet, beide functies beschikbaar op de website van PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). De meerderheid van mutanten werden gemaakt met behulp van de MAR2xT7 (MrT7) transposon, met een kleine set gemaakt met behulp van de TnPhoA (phoA) transposon37. Elke transposon heeft een antibiotica-resistentie-cassette, waarmee een mutant selectie met gentamicine (MrT7) of kanamycine (phoA). De PA14NR-set van mutanten in drieënzestig 96-wells-platen is opgeslagen en omvat twee extra controle van de 96-wells-platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon. De indeling van de 96-wells-plaat gecombineerd met de online zoekprogramma’s sterk vergemakkelijkt de aangepaste ontwikkeling van screening tests waarmee gebruikers gemakkelijk om genen te identificeren mutant fenotypen is gekoppeld. De online zoekprogramma’s vergemakkelijken ook de zoek- en selectie van aanvullende relevante mutanten vereist voor verdere studies.

De PA14 en PAO1 transposon mutant bibliotheken zijn zeer belangrijke wereldwijde resources voor de wetenschappelijke gemeenschap, en zij elkaar aanvullen bij het valideren van de functie van onbekende genen en trajecten van deze bacteriële pathogenen. Toevallig, sinds de bouw van de PAO1 en PA14 transposon mutatie Bibliotheken, heeft full-DNA sequentiebepaling genoomanalyse van vele P. aeruginosa isolaten aangetoond dat PAO1 en PA14 tot verschillende belangrijke subclades van de P. aeruginosa behoren fylogenie7,39,40,41. Omdat klinisch P. aeruginosa isolaten vindt u verspreid over de fylogenie, het feit dat PAO1 en PA14 tot verschillende P. aeruginosa behoren subgroepen verhoogt de waarde van de twee transposon mutatie bibliotheken voor vergelijkende studies.

Publicaties met een beschrijving van de bouw en screening van bacteriële mutant Bibliotheken, waaronder P. aeruginosa bibliotheken35,zijn37,42, beschikbaar in de literatuur. Echter tot de beste van onze kennis, geen gepubliceerde protocollen beschrijven gedetailleerde procedures en technieken die worden gebruikt voor replicatie, onderhoud en validatie van bacteriële mutant bibliotheken zijn beschikbaar.

De methodologie uiteengezet in deze publicatie beschrijft een set van drie protocollen die het gebruik vergemakkelijken en onderhoud van de PA14NR Set. Het eerste protocol beschrijving van replicatie van de bibliotheek zoals aanbevolen voor de ontvangers van de PA14NR Set. Het tweede protocol bevat richtsnoeren voor de strepen, groeiende en opslaan van individuele mutanten geïdentificeerd met behulp van de PA14NR Set. Het derde protocol beschrijft kwaliteitscontrole technieken, met inbegrip van PCR versterking van fragmenten van transposon mutanten en de daaropvolgende sequencing mutant identiteit te bevestigen. Deze set van protocollen kan ook worden aangepast voor de replicatie en het onderhoud van andere bacteriële mutant bibliotheken of collecties. De replicatie van bacteriële mutant bibliotheken of collecties is zeer aangeraden voor het behoud van de integriteit van de “master copy” (originele exemplaar ontvangen). Replicatie van meerdere kopieën van de PA14NR Set voor routinematige laboratoriumgebruik minimaliseert de kans op besmetting van de interwell van het originele exemplaar.

Protocol

Let op: Gebruik standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen bij het verwerken van P. aeruginosa, een menselijke pathogenen. Als u een immuungecompromitteerde individu bent of een medische aandoening die uw gevoeligheid voor bacteriële infectie verhoogt, bijzondere voorzichtigheid nemen bij het werken met P. aeruginosa. Raadpleeg de bioveiligheid-kantoor in uw instelling en toestemming van uw arts voordat u gaat werken met de de PA14 NR instellen of de mutant bibliotheken van bacteriële pathogenen. <p c…

Representative Results

Twaalf nieuwe exemplaren van de PA14NR Set werden gerepliceerd met behulp van Protocol I, en een beoordeling van de kwaliteitscontrole van de nieuwe kopieën gegenereerd werd uitgevoerd met behulp van Protocol III. PA14NR Set mutant platen samen met controle platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon (figuur 4A), werden gereplic…

Discussion

De P. aeruginosa PA14NR ligt een waardevolle bron voor de wetenschappelijke gemeenschap. Volgens de maart 2017 dataset uit Clarivate Analytics belangrijke indicatoren van de Science database, Liberati et al. (2006) 37, waarin de bouw van de PA14NR Set, is gerangschikt in de top 1% van de publicaties van de microbiologie. Google Scholar rapporten meer dan 600 citaten van de Liberati et al. (2006) originele manuscript vanaf augustus 2017. De bibliotheek heeft een …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedank Lisa Philpotts van de MGH Treadwell virtuele bibliotheek voor haar begeleiding in de database zoeken. Dit werk werd gesteund door de Cystic Fibrosis Stichting (YONKER16G0 en HURLEY16G0) en NIH NIAID (BPH en ADE: R01 A1095338).

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Pseudomonas AeruginosaPA14NR SetTransposon Mutant LibraryReplicationQuality ControlContamination PreventionSterile TechniquesReplicator Pin SterilizationLB Agar PlatesFreezer Storage
check_url/57298?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image