Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera den intra-prostatahyperplasi injektionen av prostatacancerceller, med efterföljande kastrering. Ortotop prekliniska modeller av androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer är kritiska att studera sjukdomen i samband med en kliniskt relevant tumör närmiljön och en immunkompetenta värd.
Abstract
Ortotop tumör modellering är ett värdefullt verktyg för pre-klinisk prostatacancer forskning, eftersom det har flera fördelar över både subkutan och transgena genetiskt modifierade musmodeller. Till skillnad från subkutana tumörer innehåller ortotop tumörer mer kliniskt korrekta kärlsystemet, tumör närmiljön och Svaren till flera behandlingar. I kontrast till genetiskt modifierade musmodeller, ortotop modeller kan utföras med lägre kostnad och i mindre tid, innebär användning av mycket komplexa och heterogena mus eller mänskliga cancer cellinjer, snarare som en genetiska förändringar, och dessa cell rader kan vara genetiskt modifierade, sådan att uttrycka imaging agenter. Här presenterar vi ett protokoll till kirurgiskt injicera en luciferas - och mCherry-uttryckande murina prostatacancer cell fodrar i den främre prostata loben av möss. Dessa möss utvecklat ortotop tumörer som var icke-invasivt övervakade i vivo och ytterligare analyseras för tumör volym, vikt, mus överlevnad och immun infiltration. Ortotop tumör-bärande möss var dessutom kirurgiskt kastrerade, vilket leder till omedelbar tumörregression och efterföljande upprepning, som representerar kastrationsresistent prostatacancer. Även om tekniska skicklighet krävs för att utföra proceduren, är denna syngena ortotop modell av både androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer till stor nytta för alla utredare i fältet.
Introduction
Prostatacancer bedöms ha den högsta incidensen (161,360 män) och orsakar de tredje-mest manliga cancer dödsfall (84,590 män) i 20171. Vid diagnos, prostatacancertumörer androgen-beroende, och behandlas med kirurgisk prostatektomi, strålbehandling eller androgen deprivationsterapi (ADT), men varje behandling är associerad med flera större komorbiditeter och komplikationer2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Trots tumörregression efter ADT, nästan alla tumörer återkommer som kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). I detta skede, godkända behandlingar inkluderar docetaxel, Sipuleucel-T immunterapi, och antiandrogen små molekyler enzalutamid och abirateron, men ingen enskild terapi ger en överlevnadsfördel av mer än 5,2 månader11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. män i alla stadier av prostatacancer måste därför både förbättrade behandlingsalternativ och hantering av komorbiditeter, modellering är avgörande för vilken optimal pre-klinisk sjukdom.
Med korrekta förfarandet, kan prostata cancer cellinjer vara kirurgiskt ingjutit i murina prostatan, vilket leder till utveckling av både syngena eller xenogena ortotop tumörer. Ortotop tumör modellering är idealisk för alla tumör biologi och drog utvecklingsforskning, möjliggör tumörutveckling med en kliniskt representativa tumör närmiljön (TME). Tidigare studier har visat att subkutana (s.c.) tumörer har en förändrad tumör kärlsystemet, vilket leder till differential och mindre kliniskt korrekta Svaren till anti-angiogena terapier18,19. Dessutom observerat flera studier ökad eller minskad effekt av flera kemoterapeutika vid behandling av samma cell linje, beroende på om det var ges s.c. eller orthotopically, den senare som bäst representerade vad som syns i mänskliga cancer20,21,22. Dessutom gjorde endast i en ortotop modell av tjocktarmscancer, men inte i s.c. modellen, tumörer producerar de rätta nedbrytningsvägar enzymerna som är nödvändiga att inducera metastaser23. Slutligen immunterapier fortsätter att dyka upp i spetsen för cancerbehandling, och särskilt eftersom de har ännu att ge betydande fördelar för prostatacancer24,25, syngena prekliniska modeller med korrekt TME och dränerande lymfkörtlar i immunkompetenta värdar är kritiska.
Det finns många faktorer som är ansvariga för dessa inkonsekventa resultat baserat på tumören webbplats. Med en annan TME, cancerceller utsätts för olika vävnadsspecifika endotel och förändrad angiogenes, vilket påverkar tumören utveckling26,27. Ortotop tumörer med den rätta TME möjliggör kliniskt relevanta drug delivery, hypoxisk villkor och utvärdering av anti-angiogena terapier28. Medan genetiskt modifierade modeller (ädelstenar) innehåller en korrekt TME, de kräver långa tider för avel, hög kostnad och är ofta baserat på manipulationer av enstaka eller några gener utslagen eller i ökad utsträckning bortom kliniskt relevanta nivåer. De mänskliga eller murina prostata cancer cellinjer som används i ortotop tumörer, som mänskliga tumörer, är däremot mycket mer genetiskt komplexa både inom enstaka celler och Visa heterogenitet mellan celler29,30. Också till skillnad från pärlor, ortotop cancer cellinjer kan vara konstruerad för att uttrycka avbildningsmetoder eller ökade eller minskade nivåer av andra molekyler av intresse, och in vitro- och in-vivo experimentella resultat kan jämföras direkt. Ortotop tumörer kan också bildas från primära patientderiverade celler. Vi rapporterar här, metoden för att utföra intra-prostatahyperplasi injektioner av prostatacancerceller som bildar ortotop androgen-beroende tumörer, och, efter kastrering, återkomma som ortotop CRPC.
Protocol
Alla djur förfaranden som beskrivs i detta protokoll skall utföras i enlighet med etiska regler och godkännandet av anslåuniversitetar institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC).
1. beredning av kirurgiska material och cancerceller
- Före dagen i autoklav mikro-dissekera saxen, Graefe vävnad pincett, Graefe pincett, kirurgi, nålförare med sutur fräsar och lämpligt antal draperier. Sterilisera en 50 µL spruta och 28-gauge nålar av oxid etylengas (figur 1 c).
- Innan operationsdagen, kultur Myc-CaP celler i 10 cm rätter i RPMI kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (P/S) i en 37 ° C 5% CO2 inkubator. Självlysande eller fluorescerande tumör övervakning, transfect 293T celler med lämpliga vektorer och därefter transduce Myc-CaP celler med 0,45 µm filtreras lentivirus31. Sortera celler att generera en stabil cellinje med 100% transduktion positivitet.
Obs: Utföra alla vävnadsodling under sterila förhållanden och verifierar att alla cellinjer är mycoplasma-fri. Murina prostatacancer cell linjen används i denna studie, Myc-CaP32, är sensorik stabilt uttrycka både firefly luciferas och mCherry. Myc-CaP cell linje iss isolerade från en c-myc-överuttryck Hi-myc mus, och dessa celler innehåller en förstärkt androgenreceptorn (AR), som är androgen-beroende32 och bilda CRPC tumörer efter murina kastrering33. Alla möss i denna studie är 6-8 vecka gammal hanmöss Kandeekane/NJ. Alternativa murina prostata cancer cellinjer kan användas med möss av lämplig genetisk bakgrund, liksom mänsklig prostatacancer cell linjer eller primära patientderiverade prostatacancerceller med nedsatt immunförsvar möss. Det optimala antalet celler per injektion bör fastställas empiriskt för alternativa cellinjer. Alternativ imaging modaliteter kan dessutom användas för att visualisera tumörer, inklusive magnetresonanstomografi (Mr), positronemissionstomografi (PET) eller datortomografi (CT), liksom god Jordbrukarsed som ett alternativ till mCherry. - Kvällen innan operation, placera matrigel basalmembranet matris och fenolrött-fri på isen vid 4 ° C Tina.
- På operationsdagen, samla cellerna genom att tvätta dem med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och ta loss med 0,25% trypsin-EDTA. Neutralisera trypsin med RPMI med 10% FBS och 1% P/S.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Tvätta cellerna med 10 mL RPMI utan FBS eller P/S.
- Räkna cellerna och resuspendera cellerna i PBS med en koncentration på 6.67x107 celler/mL (1 × 106 celler/15 µL).
- Tillsätt en motsvarande volym av matrigel att skapa en 1:1 PBS/matrigel cellsuspension med en slutlig koncentration på 1 × 106 celler/30 µL och hålla cellerna på is tills injektion för att förhindra solidifiering.
Obs: Utföra intra-prostatahyperplasi injektioner inom 3 h för att förbereda matrigel cellsuspensioner. Om utför intra-prostatahyperplasi injektioner på mer än 5 möss, upprepa ovanstående steg för att förbereda en färsk matrigel cellsuspension.
2. preoperativ mus förberedelse
Obs: huset möss i universitet djuranläggningen för minst en vecka före operationen att möjliggöra adekvat anpassning och att minimera djurens stress. Steg 2.1-2.6 utförs av kirurg assistent. Alla efterföljande kirurgiska åtgärder utförs av kirurgen använder sterila handskar och kirurgiska verktyg med steril teknik.
- Söva möss med isofluran (2-5% för induktion via kammare, 1-3% för underhåll via näsan konen). Verifiera full induktion av förlusten av tå nypa reflex.
- Väga möss och administrera minst 0,05 mg/kg av de smärtstillande buprenorfin s.c.
Obs: Musen vikt ≥20 g är idealisk för framgångsrik handel-prostatahyperplasi injektioner. - Gälla båda ögonen att förebygga korneal torkning oftalmologiska salva smörjning.
- Raka all päls från buken.
- Sterilisera buken i tre rundor av cirkulär tillämpningen av kirurgisk scrub använder sterila icke-klibba kuddar följt av sterila spritkompresser. Låt buken torka.
Obs: För resten av det kirurgiska ingreppet, endast sterila handskar och kirurgiska instrument kan kontakta steriliserad mus buken. - Överföra musen liggande på en ren yta på en värmedyna direkt under målet av ett rent kirurgiska Mikroskop.
- Täck musen med en steril duk med ett litet hål som skär över buken.
3. Intra-prostatahyperplasi injektion
Obs: Utför alla kirurgiska åtgärder under sterila förhållanden. Justera mikroskopet, mus placering eller någon måste annan icke-steril objekt göras av kirurg assistent.
- Utföra en ca 1 cm snitt av det yttre flår längs mittlinjen av buken överlägsna penis och preputiala körtlar (figur 1 d).
- Separat i bindväven mellan yttre bukhuden och inre buk muskulaturen genom att öppna saxen mellan skikten.
- Utför en liknande snitt av inre buk muskulatur medan du använder pincett för att höja muskulaturen för att undvika punktering i tarmen eller urinblåsan (figur 1 d).
- Leta upp någon av de bilaterala sädesblåsorna (figur 1A, vit) / främre prostata lober (figur 1A, svart), som ofta är bakre, laterala och något bättre än urinblåsan (figur 1A, gul), men detta kan variera mellan möss . Den främre prostata loberna är genomskinlig och fäst vid den mindre krökningen av de vita sädesblåsorna.
- Försiktigt höja spetsen på seminal vesikel med Graefe vävnad tången för att skapa spänning på vävnad utan att punktera seminal vesikel (figur 1E).
- Blanda Myc-CaP matrigel lösningen av gentile pipettering (utförs av kirurg assistent), som celler kan har pelleterats, och aspirera långsamt 30 µL (1 x 106 celler) in nålen att undvika luftbubblor.
- Sätt försiktigt in en avfasning för att nålen är parallell med den långa axeln av den främre prostata loben. Injicera långsamt 30 µL i LOB och dra långsamt in nålen för att förhindra läckage (figur 1F). Verifiera tillräcklig injektion av mjölkstockning av främre prostata lob (figur 1 g).
- Håll noga seminal vesikel och injicerade prostata LOB utanför musen för cirka 30 s att tillåta matrigel att delvis stelna inom LOB. Under denna tid, samla läckage cell lösning i buken med hjälp av en steril polyester tippas applikator för att förhindra icke-ortotop tumörutveckling, utan att trycka på den injicerade prostata loben.
- Noggrant returnera seminal vesikel och injicerade prostata LOB i buken utan att sätta press på LOB. Ersätta någon externalized vävnader.
- Utföra fortlöpande suturer för att stänga den inre buk muskulaturn med 5-0 vicryl absorberbara omvänd skärande nål suturer.
- Utföra avbrutna suturer Stäng yttre bukhuden med 4-0 nylon monofilament icke-absorberbara omvänd skärande nål suturer.
Obs: Steriliserad 9 mm klammer kan också användas att stänga yttre bukhuden. Emellertid, i motsats till suturer, de stör någon efterföljande självlysande och fluorescerande tumör imaging signal. - Rengör alla verktyg med steril etanol våtservetter (öppnas med kirurg assistent) och placera dem i en glas pärla sterilizer för 30 s. Tillåt verktygen för att torka före användning på nästa musen.
- Skölj sprutan och nålen i steril koksaltlösning (öppnas med kirurg assistent) för att förhindra igensättning av kvarlevan matrigel.
Obs: En kirurg assistent bör finnas för alla operationer, utför alla icke-sterila preoperativ mus förberedelse och postoperativ mus vård, samt att blanda Myc-CaP matrigel lösningen innan injektioner. För att minimera tid, eftersom varje intra-prostatahyperplasi mus förfarande kommer att kräva 20-30 min, kan kirurg assistent börja förbereda nästa musen som kirurgen suturering nuvarande musen.
4. postoperativ mus vård
- Administrera den analgetiska meloxikam 1 mg/kg s.c. omedelbart, 24 h och 48 h efter operation.
- Tillåta möss att återhämta sig i en bur med inga sängkläder placerat halvvägs på en värmedyna. Övervaka möss i minst 30 min efter operationen tills de återfår normal rörlighet och aktivitet, efter som placerar dem i en ren bur med mat på golvet i buren.
- Ytterligare övervaka möss dagligen för korrekt sårläkning, kroppsvikt, grooming och förflyttningar efter operation. Separat mössen i enskilda burar vid någon bevisning av striderna.
- Ta bort alla återstående suturer inom 14 dagar efter operation.
5. självlysande tumör Imaging
- Förbereda sterila-filtrerad Na+ eller K+ D-luciferin, som beskrivs av tillverkaren och skyddat från ljus.
- Injicera möss inom peritoneally med 10 µL/g kroppsvikt luciferin.
- Minst 10 min senare, bild möss med en IVIS spektrum Imaging System, som tidigare beskrivits34,35.
- Analysera bilder med levande bild programvara, som tidigare beskrivits34,35.
Obs: IVIS imaging analys är användbar för att fastställa framgångsrika intra-prostatahyperplasi injektioner och inledande tumörutveckling att normalisera tumör börda bland experimentella grupper. Dock beroende på intensiteten av självlysande eller fluorescerande signalen, kan mättnad orsaka en platå i bild kvantifiering trots en ökning av faktiska tumörens storlek. I de senare stadierna av tumörtillväxt, kan IVIS imaging därför mer användbart att bestämma minskning av tumörens storlek vid framgångsrik behandling snarare ökar i storlek efter bilden mättnad.
6. tumör samling, tumör analys, överlevnad Endpoint
- Om samlande tumör för analys, humant sätt avliva möss genom CO2 exponering och sekundära cervikal dislokation eller genom alternativa IACUC godkända metoder och dissekera tumörer från buken. Tumörer bör ligger orthotopically på prostatan.
Obs: Tumörer kopplad till främre bukväggen eller seedade i hela buken indikerar dålig eller läckande intra-prostatahyperplasi injektion, och bör inte betraktas som ortotop tumörer. - Väga tumörer.
- Beräkna tumör volym som π/6 × L × B × H (L = längden på den längsta axeln av tumören, W = vinkelräta bredd, H = vinkelräta höjden).
- Tumörer kan analyseras med histologi (fix i 10% neutral buffrad formalin), flödescytometri (skapa enda cellsuspensioner), protein (förbereda vävnad lysate i RIPA bufferten), eller RNA (omedelbart plats vävnad i RNAlater).
- För immunologiska analyser, också samla prostata tumör-dränering para-aorta lymfkörtlarna (figur 1B, orange) och mjälten.
Obs: Om följande möss för överlevnad, ändpunkten för denna modell definieras som uppkomsten av hemorragisk buk ascites36 och/eller minskad mobilitet, grooming eller piloerection37. Möss för överlevnadsanalys få pre- och postoperativ analgesi (protokoll steg 2.2, 4.1) och måste kontrolleras regelbundet. Möss bör delas in i individuella burar om någon kämpar uppstår och bör vara humant avlivas vid uppkomsten av någon av ovanstående endpoint avläsning.
7. kirurgisk kastrering att modellera CRPC
- För att modellera CRPC, utföra ovanstående intra-prostatahyperplasi injektion protokoll (protokoll steg 1-5).
- Minst en vecka senare, efter tumörutveckling, utföra kirurgisk kastrering via bränning, som tidigare beskrivits38.
- Övervaka tumörregression och upprepning av självlysande imaging. Efter kastrering, tumörregression sker inom 3 dagar och tumör återfall sker inom ca 30 dagar, som representerar CRPC.
Representative Results
I detta manuskript injiceras vi kirurgiskt murina prostatacancer cell linjen, Myc-CaP, in i den främre prostata loben (figur 1A), vilket leder till utveckling av ortotop prostatacancertumörer med en kliniskt relevant TME och rätt prostata-dränerande lymfkörtlar (figur 1B). Detta utfördes med hjälp av mikro-dissekera saxen, Graefe pincett, Graefe vävnad pincett, en nålförare med sutur fräsar och en 50 µL spruta med en 28-gauge nål (figur 1 c). Efter utför en ca 1 cm mittlinjen buk snitt ovanför preputiala körtlar (figur 1 d), en seminal vesikel och bifogade främre prostata loben lokaliserades och externalized (figur 1E) och 30 µL (1 x 106 celler) av en 1:1 PBS/matrigel cellsuspension injicerades i prostatan (figur 1F), som inledningsvis verifieras av mjölkstockning av LOB och avsaknaden av läckage (figur 1 g).
För att övervaka den ortotop tumörtillväxt, transfekterade vi stabilt Myc-CaP celler för att uttrycka både firefly luciferas och mCherry, vilket möjliggör tumörer ska följas av icke-invasiva i vivo Mareld (figur 2A) och fluorescens (figur 2b), respektive. En begränsning av denna avbildning är att, beroende på styrkan på signalen, imaging kvantifiering kan mätta medan tumören fortsätter att öka i storlek. Därför, med hög signal stödnivåer, detta i vivo imaging är mer användbar för initialt normalisera tumör börda över experimentella grupper och senare bestämma minskning av tumörens storlek efter experimentella behandlingar. Ytterligare avbildningsmetoder kan också användas, såsom små djur MRI, PET eller CT.
Ortotop tumörer var dissekerade från buken på dag 30 efter intra-prostatahyperplasi injektion (figur 3A). Ortotop tumörer ska placeras på platsen för den främre prostata loben. Tumör massorna i hela buken eller knutna till främre bukväggen indikera felaktig intra-prostatahyperplasi injektion och läckage. Med rätt teknik, kan tumör volym (figur 3B) och vikt (figur 3 c) registreras med relativt litet medelfel. Som påpekat, kommer det dock vissa variabilitet med små och stora tumör massorna. Första användningen av förbehandling imaging kvantifiering att utjämna tumör bördan mellan experimentella vapen är därför avgörande för alla experiment. Ytterligare, eftersom dessa murina cancerceller skulle injiceras i immunkompetenta Kandeekane/NJ möss, TME kan analyseras med immunhistokemi (IHC) eller flödescytometri eller andra tekniker för CD3 T-celler (figur 3D) (eller andra immunceller typer). Slutligen, denna modell ger objektiva överlevnad slutpunkt, som den stora primärtumör massa orsakar hemorragiska buk ascites36 (figur 3E) och/eller minskad mobilitet, grooming eller piloerection37. Döden kan ibland också orsakas av tumörtillväxt blockerar urinproduktion.
Slutligen, denna modell kan användas för att studera både androgen-beroende prostatacancer och CRPC, den senare som ger dålig prognos och är i behov av nya behandlingsalternativ. Efter ortotop tumörutveckling, var möss kirurgiskt kastrerade, som tidigare beskrivits38. Eftersom detta är den andra stora överlevnad kirurgin, måste extra vård ges att övervaka för återhämtning och eventuella biverkningar eller komplikationer. Inom 3 dagar efter kastrering observerades stark tumörregression, följt av efterföljande tumör återkommande efter ungefär 30 dagar, som representerar CRPC (figur 4A). CRPC tumörer kan vara dissektion analyseras histologiskt och visar inte någon neuroendokrin differentiering, som de upprätthålla hög AR nivåer och är negativa för den neuroendokrina markören, synaptophysin (figur 4B).
Figur 1: främre prostata loben, dränerande lymfkörtlar och representativa teknik för intra-prostata cell injektioner. Bilder av (A) höger främre prostata lob (svart, *), fäst höger seminal vesikel (vit), höger testikel och fett pad (grön), och urinblåsan (gul), (B) bilaterala prostata-dränering para-aorta lymfkörtlar (orange), (C) Micro-dissekera saxen, Graefe pincett, Graefe vävnad pincett, en nålförare med sutur fräsar och 50 µL spruta med 28-gauge nål (vänster till höger), (D) mittlinjen snitt, (E) seminal vesikel och främre prostata loben externalisering, (F), intra-prostatahyperplasi injektion och (G) mjölkstockning av den främre prostata loben. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: In vivo självlysande och fluorescerande tumör imaging. (A) luciferas- och (B) mCherry-uttryckande ortotop Myc-CaP tumörer var avbildas med en IVIS spektrum Imaging System. Mareld kvantifierades genom total flux (fotoner/s). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ortotop tumör analyser av tumör volym, vikt, histologi för immun infiltration och överlevnad. Ortotop tumörer var dissekeras på dag 30 efter intra-prostatahyperplasi injektion och analyseras av (A) imaging, (B) tumör bruttovolymen (π/6 × L × B × H; L = längden på den längsta axeln av tumören, W = vinkelräta bredd, H = vinkelräta höjd), (C) tumör vikt, (D) CD3 IHC (skalstapeln = 100 µm), och (E) överlevnad, med objektiva slutpunkten som uppkomsten av hemorragisk buk ascites. (A-B) Data som representeras som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Intra-prostatahyperplasi injektioner med efterföljande kirurgisk kastrering till modell både androgen-beroende prostatacancer och CRPC. (A) möss med ortotop luciferas-uttryckande tumörer var fotograferad av Mareld före och efter kastration (Cx), och (B) återkommit CRPC tumörer var dissekerade (svart = ortotop prostata tumör; gul = blåsa) och analyseras av H & E, AR IHC, och synaptophysin IHC (med positiv murina kontroll) (skalstapeln = 50 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I detta manuskript redogöra vi för protokollet om du vill utföra kirurgiska intra-prostatic cancer cell injektioner. Vi utnyttjas av androgen-beroende och MYC -överuttryck (MYC överuttryck syns upp till 80-90% av mänsklig prostatacancer39) murina prostatacancer cell fodrar, Myc-CaP, ursprungligen isolerats från Hi-Myc mus32 ,33. Denna cellinje var stabilt sensorik för att uttrycka både luciferas och mCherry, för icke-invasiv i vivo självlysande och fluorescerande tumör imaging, respektive. Ytterligare, kirurgisk kastrering utfördes också efter androgen-beroende tumörutveckling, leder till tumörregression och efterföljande upprepning. Därför, vi tillhandahåller detaljer till modell både ortotop androgen-beroende prostatacancer och CRPC under en immunkompetenta värd.
MYC-CaP celler injicerades i den främre prostata loben av möss. Mus prostatan består av den främre, ventrala och dorsolaterala prostata loberna och mänskliga prostatan består av en perifer zon, övergångsbestämmelser zon och centrala zonen inom en enda LOB-40. Medan tidigare studier har anatomiskt och histologiskt jämfört dorsolaterala mus LOB till människans perifera zonen, platsen för majoriteten av prostatacancer41, och främre mus LOB till människans centrala zonen42, 43, mer nyligen och heltäckande analys har visat att den främre loben och dorsolaterala LOB visar närbesläktade gen uttrycksmönster, jämfört med den ventrala loben. 44 vidare prostatacancer utveckling har observerats i den främre loben av pärlor40, och, för intra-prostatahyperplasi förfarandet, den främre loben tillåter för injektion av den nödvändiga mängden cancer cell lösning med minimal läckage och variabilitet.
Med hjälp av s.c. och transgena pärla cancer modeller har flera brister och begränsningar. S.c. tumörer vuxit i en konstgjord TME har differential Svaren till kemoterapier, i motsats till båda ortotop tumörer från samma cell linjer och mänskliga sjukdomar20,21,22. Detta kan bero på den förändrade vaskulatur av s.c. tumörer, som exemplifieras av deras differentiell svar på anti-angiogena terapi18,19. Tvärtom ortotop tumörer utvecklas med en ordentlig TME, dränerande lymfkörtlar och kärlsystemet och kan utföras med murin cellinjer, därmed också möjliggör analys av tumör immunologi och svar på immunterapi.
Transgena pärlor utveckla tumörer med en ordentlig TME i en immunkompetenta värd, men dessa modeller förenklingarna vanligtvis mänskliga cancer genom att utveckla tumörer med enstaka eller några genetiska förändringar29. En analys av Myc-CaP och andra prostata cancer cellinjer visade att de innehöll mycket större somatiska kopia antalet ombyggnader och kromosomala förändringar än tumörer från Hi-Myc möss och andra pärlor som de var härledda29. Ytterligare, pärlor är begränsade av den ökade kostnaden och tidsåtgången för möss avel för att utföra experiment av tillräcklig effekt. Ortotop tumör modellering kan övervinna dessa begränsningar. Mänskliga och murina prostata cancer cellinjer innehåller många genetiska förändringar som är relevanta för mänskliga sjukdomar29, och, som human cancer, visar också stor heterogenitet mellan enskilda celler30. Ortotop murina syngena tumörer möjliggör immunologiska analyser, medan ortotop xenogena tumörer möjliggör analyser av therapeutics på mänskliga celler. Slutligen, till skillnad från med pärlor, cell linjer kan ändras innan injektion, vilket möjliggör uttryck för självlysande eller fluorescerande imaging molekyler för att övervaka tumörtillväxt, normalisera tumör börda bland experimentella grupper, övervaka svar på behandling, och Följ tumörregression och CRPC återkommande efter kirurgisk kastrering.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar lokalisering och externalisera de seminal vesikel och bifogade främre prostata loben utan skadar andra vävnader eller punktera seminal vesikel, utför en framgångsrik intra-prostatahyperplasi injektion av de 30 µL av cell suspension utan läckage, och korrekt insamling läckage för att förhindra icke-ortotop tumörutveckling i hela buken. Den största begränsningen av intra-prostatahyperplasi injektioner är att uppnå teknisk skicklighet krävs för att minimera tumör variabiliteten mellan möss. Detta är särskilt viktigt för modellering CRPC, som har extra variabel av kirurgisk kastrering. Intra-prostatically injiceras och kastrerade möss måste också följas noggrant för återhämtning och biverkningar, som har genomgått två större överlevnad operationer. En annan begränsning är tiden för varje intra-prostatahyperplasi injektion. Detta kan reduceras till som låg som 20 min och kirurgen assistent kan förbereda nästa musen som nuvarande musen att sys. Slutligen är ortotop Myc-CaP tumörer aggressiva, snabbt växande tumörer som når slutpunkten överlevnad i cirka 46 dagar (och så tidigt som 35 dagar) på grund av den primära tumören massa. Studier som kräver långsammare tumörutveckling eller långsiktiga behandlingar bör optimeras empiriskt för den första injektionen cell sammanräkning och behandling regimen. I motsats till begränsningarna av s.c. tumörer och pärlor, alla av ovanstående begränsningar av ortotop tumör modellen kan övervinnas, och ytterligare ändringar av protokollet kan göras utifrån individuella experimentella behov.
Som ortotop tumör modell innebär användning av in vitro-hanteras celler, dessa celler kan ändras beroende på studien behov. Här, ändrade vi dessa celler för att stabilt uttrycka luciferas och mCherry för i vivo tumör övervakning. Vi har även genomfört en CRISPR-Cas9 knockout av tumörsuppressor PTEN, att generera en mer aggressiv, kliniskt relevanta cellinje som växer snabbare som ortotop tumörer (manuskript i review). Fördelar med ortotop tumör modellen, möjlighet att studera både androgen-beroende prostatacancer CRPC och potential att uttrycka avbildningsmetoder eller knockdown eller overexpress Välj gener, fungerar detta protokoll som en värdefull resurs för alla prostatacancer-forskning.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag till Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Veera ketchupin (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) och Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
