لفحص يستند إلى الخلية جزيرة البنكرياس مورين للمواد الكيميائية البيئية ديابيتوجينيك
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لعزل خلايا البنكرياس جزيرة الماوس لفحص عروض توضيحية روس قبل xenobiotics بغية تحديد المواد الكيميائية إكسينوبيوتيك ديابيتوجينيك المحتملة.
Abstract
تم العثور على التعرض لبعض المواد الكيميائية البيئية في الإنسان والحيوان تسبب الأضرار الخلوية للخلايا β البنكرياس مما يؤدي إلى تطوير نوع 2 السكري (T2DM). على الرغم من أن آليات تلف الخلايا β الناجمة عن المواد الكيميائية غير واضح ومن المرجح أن تكون معقدة، إحدى النتائج المتكررة هي أن هذه المواد الكيميائية تحدث الأكسدة مما يؤدي إلى توليد الأنواع الأكسجين التفاعلية المفرط (روس) الذي حمل الأضرار التي لحقت خلية بيتا. لتحديد المواد الكيميائية البيئية المحتملة ديابيتوجينيك، نحن معزولة خلايا البنكرياس جزيرة ليلى من الفئران C57BL/6 وجزيرة مثقف الخلايا في خلية 96-جيدا لوحات الثقافة؛ ثم، كانت جرعتي الخلايا جزيرة ليلى مع المواد الكيميائية وتم الكشف عن توليد روس قبل 2 ‘7’-ديتشلوروفلوريسسين (دكفه-دا) صبغة الفلورسنت. باستخدام هذا الأسلوب، وجدت أن bisphenol A (BPA)، بنزو [أ] بيرين (BaP)، وثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs)، يمكن أن تحفز مستويات عالية من روس، مما يوحي بأنها يحتمل أن تكون قد الحث على الأضرار في الخلايا من جزيرة ليلى. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيداً لفحص ديابيتوجينيك xenobiotics. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون الخلايا المستزرعة جزيرة ليلى أيضا تكييف للتحليل في المختبر للسمية الناجمة عن المواد الكيميائية في خلايا البنكرياس.
Introduction
أصبحت الزيادة في انتشار T2DM أزمة صحية عالمية في السنوات الأخيرة، مما يشكل تهديدا خطيرا للصحة العامة1. تم العثور على العديد من العوامل ارتباطاً سببياً تنمية T2DM، بينها، توحي النتائج المتكررة أن نقطة تلاقي مشتركة واحدة من هذه العوامل هو تنظيم دورات تعريفية للأكسدة مما يؤدي إلى توليد المفرط روس2 , 3.
تم العثور على مجموعة واسعة من المواد الكيميائية البيئية بما في ذلك ثنائي الفينيل متعدد الكلور والديوكسين و BaP للحث على الأكسدة، مما قد يضعف وظيفة خلايا بيتا في البنكرياس وتؤدي إلى مقاومة الأنسولين و T2DM4. على الرغم من أن مستوى الفسيولوجية روس دوراً هاما في الوظائف الخلوية، التعرض لروس الذي يتجاوز قدرة المنظومة المضادة للأكسدة ينتج الضرر لخلايا/الأنسجة ويؤدي إلى الأمراض5. الخلايا β البنكرياس التعبير عن مستوى منخفض من الإنزيمات المضادة للأكسدة، وهكذا هي هدف حساسة لأن الضرر عنصر مؤكسد الإجهاد بوساطة6،7. التعرض المزمن لمستويات عالية من روس قد ثبت أن تسبب الخلل في خلايا البنكرياس الناجمة عن الإجهاد5 فضلا عن مقاومة الأنسولين في الكبد والأنسجة الدهنية8.
الهدف العام لهذا المشروع تطوير تحليل يستند إلى الخلية للمواد الكيميائية الشاشة لإمكاناتها ديابيتوجينيك تستند على تحريض روس في خلايا البنكرياس. يفتقر إلى إزالة السموم الأيضية البنكرياس وهو هدف حساسة للأضرار التي يسببها إكسينوبيوتيك6،7. هذا التحليل بقياس روس المتولدة في الخلايا البنكرياس مباشرة، ولذلك ينبغي أن تقدم تقريب مباشرة من الضرر الناجم عن المواد الكيميائية في البنكرياس. لتطوير هذا الأسلوب، ونحن معزولة جزيرات البنكرياس الماوس ومثقف جزيرة معزولة تحت شرط الثقافة الخلية مع المواد الكيميائية وتستخدم الجيل روس الناجمة عن المواد الكيميائية كقراءات. ويتم هذا الإجراء البسيط والفعال في تحديد المواد الكيميائية الذي يحفز روس في جزيرة معزولة؛ فإنه يمكن تطوير لتحقيق آليات السمية الخاصة بالبنكرياس في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتراكم الأدلة تشير إلى أن التعرض للمواد الكيميائية البيئية دوراً هاما في تنمية T2DM. اعترف روس المستحثة xenobiotics عاملاً مسببا محتملة المساهمة في تنمية T2DM. ويتعرض البشر لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية إكسينوبيوتيك وهناك حاجة كبيرة لتقنيات البحث رواية لتحديد فعالية سميات البنكرياس والتحقي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه مشروع تجريبي من مركز كريه برعاية نييهس ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (رقم 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
