En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans
Summary
I denne artikel vil vise vi live billeddannelse af enkelte orme beskæftiger en brugerdefineret mikrofluid enhed. I enheden, er flere orme individuelt begrænset til separate kamre, så multipleksede langsgående overvågning af forskellige biologiske processer.
Abstract
I det sidste årti, mikrofluid teknikker har været anvendt til at studere små dyr, herunder nematode Caenorhabditis elegans, og har vist sig nyttige som en bekvem live imaging platform giver præcis kontrol af kapaciteter eksperimentelle betingelser i realtid. I denne artikel vil vise vi live billeddannelse af enkelte orme ansætte WormSpa, en tidligere udgivet brugerdefineret mikrofluid enhed. I enheden, er flere orme individuelt begrænset til separate kamre, så multipleksede langsgående overvågning af forskellige biologiske processer. For at illustrere kapacitet, udførte vi proof-of-principle eksperimenter hvor orme var smittet i enhed med patogene bakterier, og dynamikken i udtryk af immunrespons gener og æglægning blev overvåget løbende i de enkelte dyr. Den enkle design og drift af denne enhed gør det velegnet til brugere uden tidligere erfaring med mikrofluid-baserede eksperimenter. Vi foreslår, at denne tilgang vil være nyttig for mange forskere interesseret i længderetningen observationer af biologiske processer på veldefinerede betingelser.
Introduction
Ændringer i de miljømæssige forhold kan føre til aktivering af genetiske programmer ledsaget af induktion og repression af udtryk af specifikke gener1,2. Disse kinetic ændringer kan være variabel blandt væv i de samme dyr og mellem forskellige dyr. Undersøgelser af sådanne genetiske programmer kræver derfor metoder, der tillader langsgående billeddannelse af enkelte dyr og opnå præcis dynamisk styring af miljøforhold.
I de seneste år, har microfabricated fluidic enheder været brugt til at studere mange aspekter af reaktion og opførsel i små dyr, herunder orme, fluer, vand bjørne og flere3,4,5,6, 7. Programmer omfatter, for eksempel dybe fænotyper, optogenetic optagelse af neuronal aktivitet som svar på kemiske stimuli, og sporing af motor adfærd som bevægelse og pumpe8,9,10 , 11.
Mikrofluid-baserede tilgange holde mange egenskaber, der kunne gavne langsigtede langsgående billeddannelse af reaktion på miljømæssige stikord, herunder præcise dynamisk kontrol af de lokale mikromiljø, fleksibelt design, der giver mulighed for vedligeholdelsen af enkelte dyr i separate kvartaler og gunstige attributter for billeddannelse. Opretholde dyr i en mikrofluid afdeling i lang tid med minimal negativ indvirkning på deres godt væsener er dog en udfordring, som kræver særlig opmærksomhed i udformningen af mikrofluid enheden og i udførelsen af forsøget.
Her demonstrere vi brugen af WormSpa, en mikrofluid enhed for langsgående billeddannelse af Caenorhabditis elegans. 5 individuelle orme er begrænset i kamre. En konstant lav flow af flydende og bakteriel suspension sikrer orme er velnærede og tilstrækkelig aktiv til at bevare et godt helbred og lindre stress, og strukturen i afdelingerne tillader orme at lægge æg. Enkelheden i konstruktionen og driften af WormSpa bør tillade forskere uden tidligere erfaring i mikrofluidik at integrere denne enhed i deres egen forskningsplaner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrofluid værktøjer giver flere fordele i at studere orme. Imaging i en PDMS tilbyder indretning højere billeddiagnostiske kvalitet sammenlignet med en standard NGM agar plade. Flere billeder kan tages fra et enkelt worm, i modsætning til traditionelle metoder, hvor dyr er plukket fra pladen og monteret på et objektglas til billedbehandling. Derudover kan mikromiljø, orme bor holdes konstant eller moduleret som ønsket, tillader præcis kortlægning mellem sammensætningen af miljøet og svar af dyrene.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation gennem tilskud PHY-1205494 og MCB-1413134 (EL) og National Research Foundation i Korea grant 2017R1D1A1B03035671 (bekymret).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip – Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- . . NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
