פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans
Summary
במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.
Abstract
בעשור האחרון, microfluidic הוחלו ללמוד חיות קטנות, כולל את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, וטכניקות הוכיחו שימושי כמו פלטפורמה נוחה הדמיה חיה מתן יכולות לשליטה מדויקת של תנאים ניסיוני בזמן אמת. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת WormSpa, מכשיר שפורסמו קודם לכן microfluidic מותאם אישית. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים. כדי להמחיש את היכולת, אנחנו ביצע ניסויים הוכחה של עקרון בו תולעים נדבקו את ההתקן עם חיידקים פתוגניים, וכל הדינמיקה של ביטוי גנים התגובה החיסונית ביצה הנחת נוטרו באופן רציף של הפרט בעלי חיים. פשוט העיצוב ואופן הפעולה של מכשיר זה הופכים אותו למתאים עבור משתמשים עם לא נסיון עם microfluidic מבוסס ניסויים. אנו מציעים כי גישה זו יהיה שימושי עבור חוקרים רבים מעוניינים תצפיות האורך של תהליכים ביולוגיים בתנאים מוגדרים היטב.
Introduction
השינויים בתנאי הסביבה עלולה להוביל ההפעלה של תוכניות גנטי בליווי אינדוקציה ודיכוי של הביטוי של גנים ספציפיים1,2. שינויים אלה קינטי עשוי להיות משתנה בין הרקמות החיות באותה, בין בעלי חיים שונים. מחקרים של תוכניות כאלה גנטי ולכן קוראים שיטות לאפשר הדמיה האורך של חיות בודדות ומספקים שליטה מדויקת דינמיות של תנאים סביבתיים.
בשנים האחרונות, microfabricated פלואידים שימשו ללמוד היבטים רבים של התגובה וההתנהגות חיות קטנות, כולל תולעים, זבובים, דובוני מים עוד3,4,5,6, 7. יישומים לכלול, לדוגמה, phenotyping עמוק, optogenetic הקלטה של פעילות. עצבית בתגובה לגירויים כימיים, ומעקב אחר של התנהגויות מוטוריות כגון גפיים ו-8,שאיבה9,10 , 11.
גישות Microfluidic להחזיק נכסים רבים יכול להועיל ארוכת טווח אורכי הדמיה של תגובה לאותות סביבתיים, לרבות שליטה מדויקת דינמיות של microenvironment המקומי, עיצוב גמיש המאפשר קיום חיות בודדות רבעים נפרדים, וכן תכונות חיוביות עבור הדמיה. אולם, שמירה על בעלי חיים בתוך תא microfluidic במשך זמן רב עם השפעה שלילית מינימלית על בני שלהם היטב הוא אתגר, המחייב טיפול מסוים בעיצוב של המכשיר microfluidic, כמו גם ביצוע הניסוי.
כאן אנחנו מדגימים את השימוש WormSpa, מכשיר microfluidic עבור הדמיה האורך של Caenorhabditis elegans. 5 תולעים בודדים מרותק צ’יימברס. שוטף נמוכה של השעיה נוזלי ובקטריאליות ערבויות כי תולעים הם מוזן היטב ופעיל מספיק כדי לשמור על בריאות טובה, להקל על הלחץ, המבנה של התאים מאפשר תולעים להטיל ביצים. הפשטות של העיצוב ואופן הפעולה של WormSpa צריך לאפשר חוקרים ללא נסיון ב מיקרופלואידיקה לשלב התקן זה תוכניות מחקר משלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidic כלים מספקים יתרונות רבים בלימוד תולעים. התקן דימות in PDMS מציע איכות הדמיה גבוהה יותר לעומת צלחת אגר NGM סטנדרטי. ניתן לקחת תמונות מרובות של תולעת יחיד, לעומת שיטות מסורתיות שבו בעלי חיים הרים מהצלחת והוקמה בשקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשמור את microenvironment שבו שוכנים תולעים ק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מענקים PHY-1205494 ו- MCB-1413134 (EL) ועל ידי 2017R1D1A1B03035671 המענק של קרן המחקר הלאומי של קוריאה (KSL).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip – Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- . . NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
