Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans
Summary
In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.
Abstract
In het laatste decennium, microfluidic technieken zijn toegepast om te bestuderen van kleine dieren, met inbegrip van de nematode Caenorhabditis elegans, en zijn nuttig als een handige levende imaging platform bieden mogelijkheden voor een nauwkeurige besturing van gebleken experimentele omstandigheden in real time. In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen, WormSpa, een apparaat van de eerder uitgegeven aangepaste microfluidic in dienst. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen. Ter illustratie van het vermogen, wij aantonen van de principiële experimenten waarin wormen in het apparaat met pathogene bacteriën besmet waren, en de dynamiek van de expressie van genen van de immuunrespons en het leggen van eieren waren doorlopend gecontroleerd in individuele uitgevoerd dieren. Het eenvoudige ontwerp en de werking van dit apparaat maken het geschikt voor gebruikers geen ervaring heeft met microfluidic gebaseerde experimenten. Wij stellen voor dat deze aanpak nuttig voor veel onderzoekers ook geïnteresseerd in de lengterichting opmerkingen van biologische processen onder welomschreven voorwaarden zitten zal.
Introduction
Wijzigingen in de omgevingscondities kunnen leiden tot activatie van genetische programma’s begeleid door inductie en onderdrukking van de expressie van specifieke genen1,2. Deze kinetische veranderingen kunnen variabele onder weefsels in dezelfde dieren en tussen verschillende dieren. Studies van dergelijke genetische programma’s pleit daarom voor methoden die verlenen nauwkeurige dynamische controle van milieuomstandigheden en longitudinale beeldvorming van individuele dieren.
In de afgelopen jaren zijn microfabricated fluidic apparaten gebruikt om het bestuderen van vele aspecten van respons en gedrag bij kleine dieren, zoals wormen, vliegen, water beren en meer3,4,5,6, 7. Toepassingen omvatten bijvoorbeeld, diepe fenotypering, optogenetic opnemen van neuronale activiteit in reactie op chemische stimuli en volgen van gedrag van de motor zoals motoriek en pompen8,9,10 , 11.
Microfluidic-gebaseerde benaderingen houden veel eigenschappen die op lange termijn longitudinale beeldvorming van antwoord op het milieu signalen, met inbegrip van nauwkeurige dynamische controle van het lokale communicatie, flexibel ontwerp waarmee onderhoud van kunnen profiteren individuele dieren in de afzonderlijke kwartalen en gunstige kenmerken voor imaging. Behoud van dieren in een microfluidic kamer voor een lange tijd met een minimale negatieve impact op hun mens goed is echter een uitdaging, waarvoor bijzondere aandacht in het ontwerp van het microfluidic-apparaat alsook bij de uitvoering van het experiment.
We laten hier zien dat het gebruik van WormSpa, een microfluidic apparaat voor longitudinale beeldvorming van Caenorhabditis elegans. 5 individuele wormen zijn beperkt in de kamers. Een constante lage stroom van vloeibare en bacteriële suspensie garandeert dat wormen zijn goed gevoed en voldoende actief goede gezondheid te behouden en te verlichten stress, en de structuur van de kamers laat wormen om eieren te leggen. De eenvoud van het ontwerp en de werking van WormSpa moeten onderzoekers zonder eerdere ervaring in microfluidics te nemen van dit apparaat in hun eigen onderzoeksplannen toestaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidic tools bieden veelvoudige voordeel halen uit het bestuderen van wormen. Beeldvorming in een PDMS biedt apparaat hogere grafische kwaliteit ten opzichte van een standaard NGM agarplaat. Meerdere afbeeldingen kunnen afkomstig zijn uit een enkele worm, in tegenstelling tot de traditionele methoden waarin dieren zijn geplukt uit de plaat en gemonteerd op een microscoopglaasje voor imaging. Daarnaast kan de communicatie waarin wormen zich bevinden worden gehouden, constante of gemoduleerde zoals gewenst, toelaat n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation via subsidies PHY-1205494 en MCB-1413134 (EL) en door de nationale onderzoek Stichting van Korea subsidie 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
Materials
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip – Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- . . NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
