JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

Abstract

여기, 우리-수 지 intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation를 사용 하 여 thioether-곁에 펩 티 드의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 난, 난 + 4 개의 위치에 알 켄/alkyne 사이드 체인을 소유 하는 amino acids 및 시스테인 잔류물 사이 솔루션 intramolecular thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여 비닐 황화 닿는 펩 티 드의 준비를 설명 합니다. 선형 펩 티 드 표준 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)을 사용 하 여 합성 했다. Thiol 한 hydrothiolation는 intramolecular thio-ene 반응 또는 펩 티 드의 길이 따라 intermolecular thio-ene 반응 중 하나를 사용 하 여 실시 됩니다. 이 연구에서 intramolecular thio-ene 반응 수 지에 따라 선형 펩 티 드의 완전 한 합성 시스테인 잔류물의 trityl 그룹의 deprotection를 사용 하 여 짧은 펩 티 드의 경우 수행 됩니다. 수 지 photoinitiator 4 methoxyacetophenone (지도) 및 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP)를 사용 하 여 UV 방사선을 설정 합니다. Intermolecular thiol-ene 반응 Fmoc Cys 오 N, N-dimethylformamide (DMF) 용 매에 용 해 하 여 수행 됩니다. 이 다음 수 지를 켄 베어링 잔류물을 사용 하 여 펩 티 드와 함께 반응. 그 후에, macrolactamization는 활성화 시 약 지에로 benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), 및 4-Methylmorpholine (NMM)를 사용 하 여 밖으로 수행 됩니다. Macrolactamization, 다음 펩 티 드 종합은 계속 표준 SPPS를 사용 하 여. Thio-yne hydrothiolation의 경우 선형 펩 티 드 수 지에서 죽 습, 건조, 이며 이후 degassed DMF에 녹아. 이것은 다음 photoinitiator 2, 2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA)와 UV 빛을 사용 하 여 반구. 반응에 따라 DMF 증발 하 고 원유 찌 꺼 기 침전은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 정화. 이러한 방법은 수 세대 thioether 곁 순환 펩 티 드의 우수한 기능 그룹 허용 및 좋은 수확량을가지고 thio-ene 또는 yne 클릭 화학의 사용을 단순화 하기 위해 작동 합니다. 펩 티 드로 thioether의 소개의 시스테인 잔류물 및 자연의를 이황화 채권 기준으로 redox 불활성 이다.

Introduction

단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 변조 하는 ligands의 개발 현대 약물 발견에 대 한 매력적인 접근을 제공 합니다. 따라서, 많은 노력은 PPIs1,2,3변조 효율적으로 수 공부 소설 화학 형식으로 투자 되었다. PPIs는 일반적으로 얕은 크거나 단종 상호 작용 표면, 구성 하 고 작은 분자 PPIs4,5의 변조에 대 한 부적 절 한 ligands로 일반적으로 간주 됩니다. 적당 한 노출 상호 작용 표면 면적, 짧은 펩 티 드 단백질 인터페이스의 구조 기능을 모방 하는이 문제가6,7를 해결 하기 위해 이상적인 후보자를 나타냅니다. 그러나, 짧은 펩 티 드 일반적으로 수성 솔루션에 구조화 된 되지 않습니다. 이 물 분자의 펩 티 드 등뼈 및 잘 정의 된 conformations intramolecular 수소 결합 네트워크와 경쟁 하는 물8entropically 유리한는 사실 때문입니다. 또한, 펩 티 드의 본질적으로 낮은 안정성 및 세포 침투성 속성 주로 생물 학적 응용9,10에 그들의 사용을 제한. 단백질 데이터 은행 (PDB) 분석 > 짧은 α-나선 상호 작용11를 포함 하는 PPIs의 50%. 따라서, 다른 화학 방법 나선 안정화에 관한 개발 되었습니다. 이들은 이황화/thioether 유대 형성12,,1314, 반지-닫는 metathesis15, 락탐 반지 형성16를 포함, 화학17의 추가 “클릭” perfluoroarenes18,19, 그리고 비닐 황화 대형20.

안정된 헬리컬 펩 티 드 널리 p53, 등 다양 한 세포내 목표에 대 한 활용은 에스트로겐 수용 체, Ras, bcl-2 가족 단백질, 그리고 다른 사람21,22,,2324. ALRN-6924, 모든 탄화수소 MDM2 및 MDMX의 펩 티 드 이중 억제제를 붙인, 임상 조사25현재 사용 되 고. 지난 몇 년 동안, 우리의 그룹은 thiol ene와 thiol-yne 반응26,,2728를 사용 하 여 새로운 펩 티 드 안정화 방법의 개발에 집중 했다. 일반적으로, 우리는 자연스럽 게 풍부한 시스테인 사용 되 면 이러한 사진 시작 반응 온화한 조건 하에서 효율적인는 증명 하고있다. 또한, 우리가 이러한 반응 우수한 기능 그룹 허용 바이오 직교 고 펩 티 드 및 단백질 수정29적용할 수 입증 되었습니다 나타났습니다. 결과 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드 크게 제약 펩 티 드의 화학 공간을 개선 정한 밧줄에 수정 센터를 제공 하 고 수많은 생물 학적 응용 프로그램30 사용에 대 한 적용할 수 입증 ,3132. 날짜 하려면, 제한 된 보고서만 thiol-ene/thiol-yne 펩 티 드 cyclization에 관한 설명 했습니다. 2009 년 Anseth 그 외 여러분 에 의해 출판, 연구에는 수 지에 intramolecular thiol-ene 시스테인과 활성화 된 알 켄 사이 펩 티 드 cyclization에 대 한 반응은 시연된33. 2015 년에 chou의 외. 2 구성 요소 급진 시작된 thiol-ene 반응34 와 후속, 순차 thiol-yne/한 커플링 반응35스테이플링 펩 티 드에 대 한 설명. 최근에, 우리는 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드20,,2627에 따라 작품의 시리즈 설명. 이 프로토콜에는 광범위 한 연구 공동체에 대 한 도움이 될 것입니다 희망에서 위에서 언급 한 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드의 상세한 종합을 설명 합니다.

Protocol

1. 장비 준비 수동 펩 티 드 합성 장치에 대 한 효율적인 증기 두건에서 진공 매니폴드 (테이블의 재료)를 배치 합니다. 다음, 진공 매니폴드에 3 방향 stopcocks를 놓고 질소 또는 아르곤 가스 라인에 그들을 연결 합니다. 고무 격 막 사용 하 여 모든 사용 하지 않는 후미 모자. 수 지 가득 열 (0.8 x 4 cm, 10 mL 저수지, 재료의 표참조) 매니폴드 3 방향 stopcocks (<strong cl…

Representative Results

펩 티 드 Ac YmS5AAAC NH2 와 그 cyclized 제품 Ac-Y-(쿠-1, 5)-[mS5AAAC]-의 HPLC 및 MS 스펙트럼 NH2 수 지에 intramolecular thiol-ene photoreaction를 사용 하 여 생성 된 그림에에서 묘사 6B. 주기적인 펩 티 드의 선형 전조를 기준으로 동일한 분자량을 발견. 그러나, HPLC 보존 시간이 약 2 분 같은 분리 조건 하에서 그것의 선구자 보다 이전 수 ?…

Discussion

그림 3에 설명 된 수 지에 intramolecular thio-ene cyclization trityl 그룹의 시스테인 잔류물의 제거 이후 photoreaction에 대 한 중요 한 단계가 될 발견 되었습니다. 또한, 이전에 펩 티 드 분자 무게와 반응으로 동일한 것으로 밝혀졌다 다음 그림 6B에 그려져 있습니다. 따라서, HPLC id 또는 DTNB 분석 결과 사용 하 여 반응을 모니터 하기 위해 필요 합니다. Intermolecular t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 인정 (제 21372023, 21778009 및 81701818); 중국 보조금의 자연 과학 재단에서 재정 지원 과학과 기술 (No. 2015DFA31590); 중화 인민 공화국의 심천 과학 및 기술 혁신 위원회 (제 JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250, 및 GJHS20170310093122365); 그리고 중국 박사 후 과학 재단 (No. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image