JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Chemistry

Opprette Thioether/Vinyl Sulfide-bundet spiralformede peptider Via Foto-indusert Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Vi presenterer en protokoll for bygging av thioether/vinyl sulfide-bundet spiralformede peptider bruker Foto-indusert thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Her beskriver vi en detaljert protokoll forberedelse til thioether-bundet peptider bruker på harpiks intramolekylære/intermolekylære thiol-ene hydrothiolation. I tillegg beskriver denne protokollen utarbeidelse av vinyl-sulfide-bundet peptider ved hjelp av i-løsning intramolekylære thiol-yne hydrothiolation mellom amino acids som har alken/alkyne siden kjeder og cystein rester på jeg, jeg + 4 posisjoner. Lineær peptider ble syntetisert bruker standard Fmoc-basert solid-fase peptid syntese (SPPER). Thiol-ene hydrothiolation er utført en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon eller en intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon, avhengig av peptid lengden. I denne forskningen utføres en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon ved kortere peptider bruker på harpiks deprotection av trityl grupper av cystein rester etter fullført syntesen av lineær peptid. Harpiks settes da til UV bestråling med photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kart) og 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). Intermolekylære thiol-ene reaksjonen utføres smelte Fmoc-Cys-OH i en N, N-(DMF) dimethylformamid. Dette er så reagert med peptid bruker alken rentebærende rester på harpiks. Etter at utføres macrolactamization ved hjelp av benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) og 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivisering reagenser på harpiks. Etter macrolactamization, peptid syntese er fortsatt bruke standard SPPER. Ved deg selv thio-yne-hydrothiolation er den lineære peptid kløyvde fra harpiks, tørket og senere oppløst i degassed DMF. Dette er så irradiated bruker UV-lys med photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Etter reaksjonen, DMF er fordampet og råolje rester bidrar og renset med høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Disse metodene kan fungere for å forenkle generering av thioether-bundet syklisk peptider skyldes bruk av deg selv thio-ene/yne Klikk kjemien som besitter overlegen funksjonsgruppe toleranse og god avkastning. Innføring av thioether obligasjoner i peptider utnytter nukleofil natur cystein rester og er redoks-inert i forhold til disulfide obligasjoner.

Introduction

Utviklingen av ligander å modulere protein-protein interaksjoner (PPIs) gir en attraktiv tilnærming for moderne medisiner. Dermed har mye innsats blitt investert i studere romanen kjemiske modaliteter som kunne effektivt modulerer PPIs1,2,3. PPIs vanligvis består av grunne, store og/eller utgåtte samspill overflater, og små molekyler er vanligvis vurdert å være uegnet ligander for modulering av PPIs4,5. Med et egnet eksponert samspill område representerer kort peptider som etterligner strukturfunksjonene protein grensesnitt ideelle kandidater å løse denne problem6,7. Men er kort peptider ustrukturerte i en vandig løsning. Dette er på grunn av det faktum at molekylene som konkurrerer med intramolekylære hydrogen bonding nettverket peptid ryggraden og veldefinert konformasjonen er entropically ugunstige i vann8. I tillegg peptidene lav iboende stabilitet og permeabilitet celleegenskaper i stor grad begrense deres bruk i biologisk programmer9,10. Ifølge protein databank (PDB) analyse, > 50% av PPIs involverer kort α-helix interaksjoner11. Dermed har kjemiske metoder blitt utviklet i forhold til helix stabilisering. Disse inkluderer disulfide/thioether bond formasjon12,13,14, ring-avsluttende metathesis15, Laktam ring formasjon16, “Klikk” kjemi17, tillegg perfluoroarenes18,19og vinyl-sulfide formasjon20.

Stabilisert spiralformede peptider benyttes mye for ulike intracellulær mål, inkludert p53, østrogen reseptorer, Ras, BCL-2 familie proteiner, og andre21,22,23,24. ALRN-6924, en all-hydrokarbon stiftet peptid dobbelt hemmer MDM2 og MDMX, blir brukt for klinisk undersøkelse25. I de siste årene, har vår gruppe fokusert på utviklingen av romanen peptid stabilisering metoder med thiol-ene og thiol-yne reaksjoner26,27,28. Vanligvis har vi vist at disse Foto startet reaksjoner er effektiv under mild forhold når naturlig rikelig cystein brukes. I tillegg har vi vist at disse reaksjonene har en utmerket funksjonsgruppe toleranse, er bio-ortogonale, og har vist seg for å være gjeldende peptid og protein modifikasjoner29. De resulterende thioether/vinyl sulfide bundet peptidene i stor grad forbedre kjemiske løpet av begrensning peptider, gir en labil på tjore endring center og er bevist for å være gjeldende for bruk i mange biologiske programmer30 ,31,32. Hittil har bare begrenset rapporter blitt beskrevet om thiol-ene/thiol-yne peptid cyclization. I en studie publisert av Anseth et al. i 2009, var en reaksjon på harpiks intramolekylære thiol-ene for peptid cyclization mellom aktivert alkener med cystein demonstrert33. I 2015, Chou et al. beskrevet en to-komponent radikale initiert thiol-ene reaksjon for peptid stifting34 og påfølgende, sekvensiell thiol-yne/ene kopling reaksjon35. Nylig beskrev vi en rekke arbeid basert på thioether/vinyl sulfide bundet peptider20,26,27. Denne protokollen beskriver en detaljert syntese av ovennevnte thioether/vinyl sulfide bundet peptider i håp at det vil være nyttig for bredere forskning samfunnet.

Protocol

1. utstyr forberedelse For manuell peptid-syntese apparater, plassere en vakuum manifold (Tabell for materiale) i en effektiv avtrekksvifte. Deretter sted treveis stopcocks på vakuum manifold og koble dem til en nitrogen eller argon gass linje. Cap alle ubrukte viker med gummi septa. Koble harpiks fylt kolonner (0.8 x 4 cm, 10-mL reservoaret, se Tabell of Materials) til manifold bruker treveis stopcocks (figur 1). Bruk en pumpe som er ko…

Representative Results

Til HPLC og MS spectra peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 og cyclized produktet Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 som ble generert ved hjelp av photoreaction på harpiks intramolekylære thiol-ene er avbildet i figur 6B. de sykliske peptid ble funnet for å ha en identisk molekylvekt i forhold til forløperen sin lineær. Men ble tiden sin HPLC observert for å være ca 2 min tidligere enn i forløperne oppstiller separasjon. …

Discussion

I på-harpiks intramolekylære deg selv thio-ene cyclization beskrevet i Figur 3, ble fjerning av gruppen trityl i en cystein rester funnet for å være et kritisk punkt for den påfølgende photoreaction. I tillegg avbildet peptid molekylvekt før og etter reaksjonen var funnet for å være identiske som i figur 6B. Derfor er bruk av en såkalt HPLC-ID eller en DTNB analysen nødvendig for å overvåke reaksjonen. Ved intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra Natural Science Foundation av Kina tilskudd (nr. 21372023, 21778009 og 81701818); Departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina (nr. 2015DFA31590); Shenzhen vitenskap og teknologi innovasjon Committee (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 og GJHS20170310093122365); og Kina postdoktor Science Foundation (nr 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image