Vi presenterer en protokoll for bygging av thioether/vinyl sulfide-bundet spiralformede peptider bruker Foto-indusert thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.
Her beskriver vi en detaljert protokoll forberedelse til thioether-bundet peptider bruker på harpiks intramolekylære/intermolekylære thiol-ene hydrothiolation. I tillegg beskriver denne protokollen utarbeidelse av vinyl-sulfide-bundet peptider ved hjelp av i-løsning intramolekylære thiol-yne hydrothiolation mellom amino acids som har alken/alkyne siden kjeder og cystein rester på jeg, jeg + 4 posisjoner. Lineær peptider ble syntetisert bruker standard Fmoc-basert solid-fase peptid syntese (SPPER). Thiol-ene hydrothiolation er utført en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon eller en intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon, avhengig av peptid lengden. I denne forskningen utføres en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon ved kortere peptider bruker på harpiks deprotection av trityl grupper av cystein rester etter fullført syntesen av lineær peptid. Harpiks settes da til UV bestråling med photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kart) og 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). Intermolekylære thiol-ene reaksjonen utføres smelte Fmoc-Cys-OH i en N, N-(DMF) dimethylformamid. Dette er så reagert med peptid bruker alken rentebærende rester på harpiks. Etter at utføres macrolactamization ved hjelp av benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) og 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivisering reagenser på harpiks. Etter macrolactamization, peptid syntese er fortsatt bruke standard SPPER. Ved deg selv thio-yne-hydrothiolation er den lineære peptid kløyvde fra harpiks, tørket og senere oppløst i degassed DMF. Dette er så irradiated bruker UV-lys med photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Etter reaksjonen, DMF er fordampet og råolje rester bidrar og renset med høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Disse metodene kan fungere for å forenkle generering av thioether-bundet syklisk peptider skyldes bruk av deg selv thio-ene/yne Klikk kjemien som besitter overlegen funksjonsgruppe toleranse og god avkastning. Innføring av thioether obligasjoner i peptider utnytter nukleofil natur cystein rester og er redoks-inert i forhold til disulfide obligasjoner.
Utviklingen av ligander å modulere protein-protein interaksjoner (PPIs) gir en attraktiv tilnærming for moderne medisiner. Dermed har mye innsats blitt investert i studere romanen kjemiske modaliteter som kunne effektivt modulerer PPIs1,2,3. PPIs vanligvis består av grunne, store og/eller utgåtte samspill overflater, og små molekyler er vanligvis vurdert å være uegnet ligander for modulering av PPIs4,5. Med et egnet eksponert samspill område representerer kort peptider som etterligner strukturfunksjonene protein grensesnitt ideelle kandidater å løse denne problem6,7. Men er kort peptider ustrukturerte i en vandig løsning. Dette er på grunn av det faktum at molekylene som konkurrerer med intramolekylære hydrogen bonding nettverket peptid ryggraden og veldefinert konformasjonen er entropically ugunstige i vann8. I tillegg peptidene lav iboende stabilitet og permeabilitet celleegenskaper i stor grad begrense deres bruk i biologisk programmer9,10. Ifølge protein databank (PDB) analyse, > 50% av PPIs involverer kort α-helix interaksjoner11. Dermed har kjemiske metoder blitt utviklet i forhold til helix stabilisering. Disse inkluderer disulfide/thioether bond formasjon12,13,14, ring-avsluttende metathesis15, Laktam ring formasjon16, “Klikk” kjemi17, tillegg perfluoroarenes18,19og vinyl-sulfide formasjon20.
Stabilisert spiralformede peptider benyttes mye for ulike intracellulær mål, inkludert p53, østrogen reseptorer, Ras, BCL-2 familie proteiner, og andre21,22,23,24. ALRN-6924, en all-hydrokarbon stiftet peptid dobbelt hemmer MDM2 og MDMX, blir brukt for klinisk undersøkelse25. I de siste årene, har vår gruppe fokusert på utviklingen av romanen peptid stabilisering metoder med thiol-ene og thiol-yne reaksjoner26,27,28. Vanligvis har vi vist at disse Foto startet reaksjoner er effektiv under mild forhold når naturlig rikelig cystein brukes. I tillegg har vi vist at disse reaksjonene har en utmerket funksjonsgruppe toleranse, er bio-ortogonale, og har vist seg for å være gjeldende peptid og protein modifikasjoner29. De resulterende thioether/vinyl sulfide bundet peptidene i stor grad forbedre kjemiske løpet av begrensning peptider, gir en labil på tjore endring center og er bevist for å være gjeldende for bruk i mange biologiske programmer30 ,31,32. Hittil har bare begrenset rapporter blitt beskrevet om thiol-ene/thiol-yne peptid cyclization. I en studie publisert av Anseth et al. i 2009, var en reaksjon på harpiks intramolekylære thiol-ene for peptid cyclization mellom aktivert alkener med cystein demonstrert33. I 2015, Chou et al. beskrevet en to-komponent radikale initiert thiol-ene reaksjon for peptid stifting34 og påfølgende, sekvensiell thiol-yne/ene kopling reaksjon35. Nylig beskrev vi en rekke arbeid basert på thioether/vinyl sulfide bundet peptider20,26,27. Denne protokollen beskriver en detaljert syntese av ovennevnte thioether/vinyl sulfide bundet peptider i håp at det vil være nyttig for bredere forskning samfunnet.
I på-harpiks intramolekylære deg selv thio-ene cyclization beskrevet i Figur 3, ble fjerning av gruppen trityl i en cystein rester funnet for å være et kritisk punkt for den påfølgende photoreaction. I tillegg avbildet peptid molekylvekt før og etter reaksjonen var funnet for å være identiske som i figur 6B. Derfor er bruk av en såkalt HPLC-ID eller en DTNB analysen nødvendig for å overvåke reaksjonen. Ved intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra Natural Science Foundation av Kina tilskudd (nr. 21372023, 21778009 og 81701818); Departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina (nr. 2015DFA31590); Shenzhen vitenskap og teknologi innovasjon Committee (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 og GJHS20170310093122365); og Kina postdoktor Science Foundation (nr 2017 M 610704).
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
vacuum manifold | promega | A7231 | |
three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |