人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養
Summary
心外膜細胞と心筋壁に成長因子を提供することによって開発し、中心部の修復に重要な役割を果たしています。ここでは、研究と彼らの発達と大人の特性の比較を可能にする培養ひと心外膜細胞に手法について述べる。
Abstract
心外膜, 心筋を覆う上皮細胞層は、虚血性損傷後、心臓の開発中に、心の修復反応での重要な役割にいます。アクティブになったとき、心外膜細胞は再生心筋細胞を提供するでは上皮間葉転換 (EMT) 知られているプロセスを経る。さらに、必須のパラクライン因子の分泌を介して、心外膜が貢献しています。心外膜の再生の可能性を完全に鑑賞するには、ひと細胞モデルが必要です。ここでは、人間の成人および胎児の心臓組織から一次派生心外膜細胞 (EPDCs) を導出する新規細胞培養モデルを概説します。EPDCs を分離するには、心外膜が心臓標本の外から解剖、単一細胞懸濁液に処理します。次に、EPDCs はメッキ、ALK 5-キナーゼ阻害剤の上皮性の表現型を維持するために SB431542 を含む追求培地で培養しました。EMT は TGFβ 刺激によって誘導されます。このメソッドは、制御された設定で人間の心外膜 EMT の過程の研究を有効にした最初の時間のため、心臓再生を助けることができる EPDCs の secretome でより多くの洞察を得ることが容易になります。さらに、この統一的なアプローチは、人間の成人および胎児心外膜挙動の直接比較のためことができます。
Introduction
心外膜、封筒、心は、極めて重要な心臓の開発と修理 (スミッツらの見直しのための単一細胞上皮層1). 発達、心外膜に起因 proepicardial 器官の開発の中心部の底部にある小さな構造。マウス、および 4 週間後の概念で、人間の発達の日 E9.5、周辺細胞はこのカリフラワー構造からの移行し、開発心筋2をカバーを開始します。単一の上皮細胞層が形成され、一度心外膜細胞の一部は上皮間葉転換 (EMT) に行われます。EMT、中に細胞は細胞接着斑などの上皮性特性を失うし、それらの発展途上の心筋に移行する能力を与える間葉系の表現型を得る。後者の 2 つのセルが形成された心外膜派生セル (EPDCs) が線維芽細胞、平滑筋細胞、および可能性のある心筋細胞、内皮細胞3を含むいくつかの心筋細胞タイプに区別できます。集団のまま (スミッツらの見直し議論の対象と4). さらに、心外膜、その成長と血管新生5,6,7、8を規制する心筋に有益なパラクリン シグナル。複数の研究は、障害の心外膜形成が心筋9,10, 血管11及び伝導システム12、強調、エッセンシャルで発育障害につながることを実証しています。心の形成に心外膜の貢献。
大人の心、心外膜は休眠層として存在が、それは虚血13の時に再開になります。心外膜再ポスト傷害のいくつかを繰り返すプロセス説明にもかかわらず増殖と EMT14などを含む心臓の開発の小さい効率的に。興味深いことに、正確なメカニズムは十分に理解されていないが修復への貢献を心外膜変更 VEGF-A mRNA16心の改善の結果、例えば、サイモシン β415と治療によって改善できるまたは心筋梗塞後の機能。心外膜は、傷ついた心臓の内因性修復を高めるために興味深い細胞ソースとみなされます。
心臓発生のメカニズムは頻繁に締めくくっているけが、中にあまり効率的な方法ではあるが。心外膜の活性化を求めて、それは決定し、胎児および大人の心外膜の全容量を比較できますは重要です。また、治療の観点から、動物実験だけでなく人間の心外膜の応答に関する知識を拡張、重要です。ここでは、分離し、細胞の培養ひと成人および胎児心外膜派生 (EPDCs) 上皮細胞の形態で、EMT を誘導する手法について述べる。このモデルでは、探索し、成人および胎児の心外膜細胞の挙動を比較を目指します。
このプロトコルの主な利点は、徹底的に検討されていない人間の心外膜材料の使用です。重要なは、説明の分離および細胞培養のプロトコルは、これらの 2 つのセルのソース間の直接比較を有効にする両方の胎児および大人の石畳 EPDCs を取得する単一の統一された方法を提供します。さらに、心外膜は分離の場所に基づいて、セルが実際に epicardially 派生17であることが保証されます。
人間の追求の分離メソッドが以前に確立されると、大抵伸長プロトコル細胞培養皿18,19に心臓や心外膜組織の部分をメッキパーツに依存してこれら。このアプローチは、部分的に彼らの上皮性の表現型を失うことが、移行するために、自発的な EMT を受けることになりやすい細胞用により選択します。現在のプロトコルの心外膜は最初の上皮の状態を維持するために分離の EPDCs を可能にする単一細胞液に処理されます。このメソッドは、したがって心外膜 EMT を勉強する固体の in vitroモデルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで人間の成人および胎児心に由来する一次心外膜細胞を分離するための詳しいプロトコル文化について述べる。これらの細胞の広範な評価は、以前に公開された17をされています。我々 は両方のセルタイプを ALK5 キナーゼ阻害剤 SB431542 による培養上皮の石畳のような細胞として維持できることを示しています。EMT は開発およびポスト傷害応答中に体内の心外膜?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はオランダ組織科学的研究 (NWO) (イタリアヴェネツィア 016.146.079)、LUMC 研究フェローシップ AMS と LUMC Bontius スティヒティング (MJG) の両方でサポートされます。
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
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