מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

Summary

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

Abstract

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מייצג מודל המתעוררים עבור המחקר של חילוף החומרים. אכן, דרוזופילה יש מבנים הומולוגיים לאברים אנושיים, בעלי מאוד שנשמרת מסלולים מטבוליים, יש אורך חיים קצר יחסית המאפשר לימוד מנגנונים בסיסיים שונים בתקופה קצרה של זמן. עם זאת, מפתיע כי באחד המנגנונים חיוני לחילוף החומרים הסלולר, הנשימה מיטוכונדריאלי לא ביסודיות נבדקה במודל זה. סביר כי המדד הנשימה מיטוכונדריאלי ב דרוזופילה בדרך כלל דורש מספר רב מאוד של אנשים, התוצאות המתקבלות אינן מאוד לשחזור. כאן, מתוארת שיטה ומאפשר המידה המדויקת של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות כמויות מינימליות של רקמה מתוך דרוזופילה. בשיטה זו, thoraxes ביתר, permeabilized באופן מכני עם מלקחיים חדה והן מבחינה כימית עם סאפונין, ומאפשר תרכובות שונות לעבור את קרום התא לווסת את הנשימה מיטוכונדריאלי. לאחר permeabilization, פרוטוקול מתבצע כדי להעריך את היכולת של מתחמי שונים של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS) להתחמצן מצעים שונים, כמו גם תגובתם של uncoupler, מעכבי מספר. שיטה זו מציג יתרונות רבים לעומת שיטות שימוש ומשום מיטוכונדריאלי, כמו זה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בגלל המיטוכונדריה עדיין אינטראקציה עם רכיבים אחרים התאית, המורפולוגיה מיטוכונדריאלי כולו. יתר על כן, מדגם ההכנות מהירים יותר, ואת התוצאות המתקבלות הן מאוד לשחזור. על ידי שילוב היתרונות של דרוזופילה כמודל לחקר מטבוליזם עם הערכת הנשימה מיטוכונדריאלי, חשוב תובנות חדשות יכול להיות חשפה, במיוחד כאשר הזבובים חווים שונים סביבתי או pathophysiological תנאים.

Introduction

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימש כאורגניזם מודל עבור מחקר גנטי עבור מעל המאה ה¹. המחקר של האורגניזם הזה הוביל לא רק ידע משמעותי על ירושה שאיי², קצב מוטציה³, הפיתוח של מערכת העצבים, את קביעת גורל התא⁴, אבל גם לאחרונה התפתחה כלי חשוב ללמוד את המנגנונים הטמון כמה מחלות כגון אלצהיימר ופרקינסון^5,6. יתר על כן, זה מודל פופולרי ללמוד את תהליך ההזדקנות, כפי שהם יכולים לגדול במספר גדול על פני תקופה קצרה של זמן יש אורך חיים קצר. הם גם בעלי מבנים הומולוגיים לאיברים אנושי, כגון לב, oenocytes (כמו hepatocyte תאים), שומן הגוף (מתפקד באופן דומה רקמת שומן בכבד ולבן), לייצר תאים (שקול לתאי β בלבלב), אינסולין, כמו גם hemolymph הובלת מטבוליטים (מקביל להדם של בעלי חוליות)⁷. יתר על כן, משעולים המרכזי של מתווך חילוף החומרים (כולל את מסלול איתות כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין מסלולים היעד של Rapamycin-תור) הם גם מאוד שנשמרת⁷. מסיבות אלו, דרוזופילה לאחרונה נוצלה כדי לתאר את המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים, במיוחד בתנאים פתולוגיים הקשורות למחלות מטבוליות כגון סוכרת⁸. רכיב מרכזי של חילוף החומרים הוא מיטוכונדריון משלב מספר מסלולים ומבצע אחת מהפונקציות הביולוגי החשוב ביותר של החיים, ייצור ATP, באמצעות תהליך זרחון חמצוני (OXPHOS). בהתחשב שלהם תפקיד מרכזי בחילוף החומרים של האורגניזם, זה לא מפתיע כי תפקוד מיטוכונדריאלי מעורבים במחלות כמו פרקינסון⁹ ו מחלות אלצהיימר¹⁰, כמו גם נוירודגנרטיביות ^{11 , 12}. הם גם המשפיעים של תהליך ההזדקנות. אכן, הם המפיקים הראשי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתא, אשר עלולה לפגוע בבריאותך לתא ריכוז גבוה דרך נזק חמצוני¹¹. הזדקנות גם היה קשור להצטברות של ניזוק או מוטציה מיטוכונדריאלי דנ א¹³,^14,mitophagy בתפקוד¹⁵ , כמו גם ליקוי להן מיטוכונדריאלי¹⁶. המיטוכונדריה הם גם גורמים מרכזיים של הומאוסטזיס של התא, כפי שהם יכולים לנצל סובסטרטים שונים כדי להתאים את מספר הסלולר פונקציות בהתאם שפע או מחסור של macronutrients^17,18.

אכן, החומרים המזינים שונים בתזונה (פחמימות, שומנים וחלבונים) מתעכל, נספג, מועבר בתאים. . הם הופכים לאחר מכן ב ציטוזול ולאחר סובסטרטים נגזר מועברים לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי שבו הם מייצרים מקבילות תוך צמצום, כגון₂NADH ו FADH¹⁹. הם אלה מקבילות תוך צמצום ואז תחמוצת על-ידי מתחמי אנזימטיות שונות של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS). מכלולים אלה מוטבעות ממברנה פנימית מיטוכונדריאלי, כגון מתחם I ו- II מורכבים. בנוסף, מתחמי אנזימטי אחרים כגון דהידרוגנאז מיטוכונדריאלי של גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז פרולין מייצגים דרכים חלופיות עבור הערך של אלקטרונים לתוך ה ETS^20,21. מתחמי “אלטרנטיבי” אלה חשובים במיוחד חרקים, כמו לפי המין, הם יכולים באופן פעיל להשתתף כדי להגדיל את הנשימה^20,22,23,21. אלקטרונים אלה ETS האכלה מערכות מועברים את ubiquinone, לאחר מכן השלישי מורכב ולאחר מכן הרביעי מורכבים, עד מקבל הסופי, חמצן מולקולרי. העברת האלקטרון הזה יוצר פרוטון-מניע כוח על פני קרום מיטוכונדריאלי הפנימי שנוסעים זירחון של ADP ATP-V מורכבים (איור 1). בהתחשב התפקיד המרכזי של מיטוכונדריה הומאוסטזיס של התא, לומד מיטוכונדריאלי חילוף החומרים באמצעות מייצג melanogaster ד את הדגם הרלוונטי כלי רב עוצמה כדי ניסחו את המנגנונים שבבסיס שונים הקשורים pathophysiological תנאים או תחת לחצים הסלולר וסביבתיים. באופן מפתיע, רק קומץ מחקרים למעשה נמדד נשימה מיטוכונדריאלי דרוזופילה^24,25,26. אכן, ניסויים במטרה להעריך את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דורשים את ניתוקה של המיטוכונדריה. למרות יתרון עבור המידה של פונקציות מיטוכונדריאלי שונות (כגון ייצור ROS או יחס P/O כמו סמן של יעילות מיטוכונדריאלי^27,28), ומשום אלה בדרך כלל דורשים כמויות די גדולות של רקמה מתוך^24,יחידים מספר²⁹. דרישה זו עבור כמויות גבוהות של רקמות ויחידים הוא גורם מגביל חשוב, במיוחד בהתחשב בעובדה כי כל אדם צריך להיות באותו הגיל, רצוי מאותו המין על הניסויים, שהופך את מידת הנשימה בזמן שונה נקודות מפרך במקרה הטוב. יתר על כן, בעוד ומשום מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה משמעותית המנגנונים הבסיסיים המסדירים את חילוף החומרים מיטוכונדריאלי, האמצעים שננקטו כדי לבודד המיטוכונדריה יש מספר חסרונות כגון הקושי להשיג תוצאות ניתן לשכפול , הפרעה של רשת מיטוכונדריאלי, ושינוי של מיטוכונדריאלי מבנה ותפקוד^29,30,31.

מטרת מחקר זה היא להציג פרוטוקול חזקים כדי למדוד את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה באמצעות רק כמות מזערית של רקמות מאנשים מעט מאוד. פרוטוקול זה מורכב מדידת חמצן מיטוכונדריאלי צריכת בחיי עיר באמצעות סיבי השריר permeabilized²⁹ מ דרוזופילה thoraxes בשילוב עם רזולוציה גבוהה respirometry^{32,33, 34 , 35}. בשיטה זו יש גם יתרונות נוספים בהשוואה לשיטת הבידוד מיטוכונדריאלי קלאסי מאז האינטראקציות עם רכיבים אחרים של התא כמו מבנה ותפקוד טוב כמו מיטוכונדריאלי יישמרו יותר ב- permeabilized סיבי^29,31,36, מה שהופך את גישה זו רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית. עם פרוטוקול זה, פונקציות מיטוכונדריאלי ניתן בצורה מדויקת להעריך באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ברק שלוש thoraxes של זבוב החומץ, עם מצעים המאפשר קביעת צריכת חמצן-מספר שלבים שונים של החוצנים. לכן, פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים בהקשר של תנאים סביבתיים או pathophysiological רבים על-ידי ניצול של המודל דרוזופילה.

למדוד את צריכת החמצן מספר שלבים שונים של החוצנים ולהעריך כיצד סובסטרטים לתרום הנשימה, מצעים שונים (איור 1), uncoupler, מעכבי נמצאות בשימוש³⁰ לאחר permeabilization של רקמות. באופן ספציפי, תוספות רציפים של סובסטרטים מבוצעות כדי לגרות את כניסתם של אלקטרונים בעלי מתחמים שונים של החוצנים. Uncoupler, קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), מצורף-ריכוז אופטימלי כדי למדוד את הנשימה הלא מצמידים, קרי, הנשימה phosphorylating מגורה צריכת חמצן מירבית. העכבות רציפים של מתחמי שאני II, III מבוצעות לאחר מכן כדי לפקח על צריכת חמצן שיורית הראוי תגובות חמצון הלא-ETS. לבסוף, ניתן להעריך יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים על ידי ההזרקה של N, N, N’, נ, – Tetramethyl – p-phenylenediamine (TMPD), ספק אלקטרון מלאכותי, ואת ascorbate. חשוב לציין כי הניסויים נערכים ב 24 °C שכן הוא הטמפרטורה בה מגודלים הזבובים.

Protocol

1. נוגדנים הכנה להכין את הפתרונות הבאים לנתיחה, permeabilization של הרקמה. להכין תמיסת השימור: 2.77 מ”מ CaK2EGTA, 7.23 מ מ K2EGTA, 5.77 מ מ נה2ATP, מ מ 6.56 MgCl2, טאורין, 20 מ מ 15 מ מ נה2phosphocreatine, imidazole 20 מ מ, dithiothreitol 0.5 מ מ, ו 50 מ מ K-MES, pH 7.1 (ניתן לאחסן ב-20 ° C). להכין סאפונין פתרון: 5 מ”ג ש…

Representative Results

עקבות נציג של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל הינו מסופק באיור2. פירובט, בנויים מוזרק בתאי יחד עם סיבי השריר permeabilized מכונים הנשימה CI-דליפה, דהיינו, כאשר המתחם מלך החוצנים הוא מגורה על ידי NADH המופק באמצעות חמצון פירובט, בנויים בא…

Discussion

במחקר זה, מתוארת שיטה עבור הכנת הדוגמא לפני המידות של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על בעיות שונות הקשורות הפרוטוקולים באמצעות ומשום מיטוכונדריאלי, בייחוד מבחינת משך מספר האנשים הדרושים. במקום לעבוד עם ומשום מיטוכונדריאלי בדרך כלל נדרש גם כמות גדולה של רקמ?…

Materials

High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Fine-tipped antimagnetic forceps	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Goettingen, Germany		Semi-micro balance (distributed by several companies)
Drosophila melanogaster wild-type w1118	Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA		Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA Storage Condition: RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	Storage Condition: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Storage Condition: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	Storage Condition: -20 °C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	Storage Condition: RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark	Sigma-Aldrich	S7900	Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	Storage Condition: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	Storage Condition: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Storage Condition: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A5285	ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C7752	Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380	Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378	Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt	Sigma-Aldrich	G7886	Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid	Sigma-Aldrich	M1296	Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.  Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.