Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

Summary

Dans cet article, on décrit une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide de respirométrie haute résolution en thoraxes perméabilisées de drosophile. Cette technique nécessite une quantité minimale de tissu par rapport à la technique d’isolement mitochondrial classique et les résultats obtenus sont plus physiologiquement pertinents.

Abstract

La drosophile, Drosophila melanogaster, représente un nouveau modèle pour l’étude du métabolisme. En effet, drosophile possèdent des structures homologues aux organes humains, de posséder des voies métaboliques hautement conservées et ont une durée de vie relativement courte qui permet l’étude des mécanismes fondamentaux différents dans un court laps de temps. Toutefois, il est surprenant que l’un des mécanismes essentiels pour le métabolisme cellulaire, la respiration mitochondriale, n’a pas été soigneusement étudié dans ce modèle. C’est probablement parce que la mesure de la respiration mitochondriale chez la drosophile nécessite généralement un très grand nombre de personnes et les résultats obtenus ne sont pas très reproductibles. Nous décrivons ici, une méthode qui permet la mesure précise de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant des quantités minimales de tissus de drosophile. Dans cette méthode, les thoraxes sont disséqués et perméabilisées mécaniquement avec une pince forte tant chimiquement avec saponine, permettant à différents composés de traverser la membrane cellulaire et moduler la respiration mitochondriale. Après perméabilisation, un protocole est effectué afin d’évaluer la capacité des différents complexes du système de transport d’électrons (ETS) pour oxyder les différents substrats, ainsi que leur réponse à un découpleur et à plusieurs inhibiteurs. Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisant des isolations mitochondriales, car il est plus physiologiquement pertinente parce que les mitochondries sont toujours en interaction avec les autres composants cellulaires et la morphologie mitochondriale est conservée. En outre, préparation de l’échantillon est plus rapides, et les résultats obtenus sont très reproductibles. En combinant les avantages de la drosophile comme modèle pour l’étude du métabolisme avec l’évaluation de la respiration mitochondriale, important de nouvelles connaissances peuvent être dévoilés, surtout quand les mouches connaissent différents environnement ou physiopathologiques conditions.

Introduction

La drosophile, Drosophila melanogaster, a servi comme un organisme modèle pour la recherche génétique pour plus d’un siècle¹. L’étude de cet organisme n’a pas seulement permis d’importantes connaissances fondamentales sur la cellule sort dosage⁴, le développement du système nerveux et mutation taux³, hérédité liée au sexe², mais a aussi récemment émergé comme un outil précieux pour étudier les mécanismes inhérents à plusieurs maladies comme l’Alzheimer et Parkinson^5,6. En outre, c’est un modèle populaire pour étudier le processus de vieillissement, car ils peuvent être déclenchés en grand nombre sur une courte période de temps et ont une durée de vie courte. Ils possèdent également des structures homologues d’organes humains, tels que les cellules (équivalents à des cellules β pancréatiques), productrices d’insuline, des corps gras (fonctionnement de même que le tissu adipeux blanc et foie), oenocytes (cellules hépatocytes), un cœur ainsi que la hémolymphe transportant des métabolites (analogue au sang des vertébrés)⁷. En outre, les voies centrales du métabolisme intermédiaire (y compris la voie de signalisation comme facteur de croissance analogue à l’insuline/insuline et les voies de la cible de la rapamycine-TOR) sont également hautement conservée⁷. Pour ces raisons, drosophile ont récemment été exploités pour décrire les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme, en particulier dans les pathologies inhérentes aux maladies métaboliques comme le diabète⁸. Une composante importante du métabolisme est la mitochondrie qui intègre de multiples voies et effectue l’une des plus importantes fonctions biologiques de la vie, la production d’ATP, par l’intermédiaire du processus de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Compte tenu de leur rôle central dans le métabolisme de l’organisme, il n’est pas surprenant que les dysfonctions mitochondriales sont impliquées dans de nombreuses maladies comme la maladie de Parkinson⁹ et Alzheimer maladies¹⁰, ainsi que dans la sclérose latérale amyotrophique ^{11 , 12}. ils sont également déterminants fondamentaux du vieillissement. En effet, ils sont les principaux producteurs de reactive oxygen species (ROS) dans la cellule, qui peut être préjudiciable à la cellule à haute concentration à travers les dommages oxydatifs¹¹. Vieillissement a été également associée à l’accumulation d’endommagés ou muté mitochondrial DNA¹³, mitophagy dysfonctionnements^14,15 ainsi que de déficience de la biogenèse mitochondriale,¹⁶. Les mitochondries sont également des facteurs déterminants de l’homéostasie de la cellule qu’ils peuvent utiliser différents substrats pour ajuster plusieurs fonctions cellulaires selon l’abondance ou la rareté des macronutriments^17,18.

En effet, les différents nutriments dans l’alimentation (glucides, lipides et protéines) sont digérés, absorbés et transportés dans les cellules. Ils sont ensuite transformés dans le cytosol, et les substrats dérivées sont transportés dans la matrice mitochondriale où elles produisent des équivalents réducteurs, comme le NADH et FADH₂¹⁹. Ces équivalents réducteurs sont ensuite oxydés par différents complexes enzymatiques du système de transport d’électrons (ETS). Ces complexes sont incorporées dans la membrane interne mitochondriale, tels que les complexes I et II complexe. En outre, autres complexes enzymatiques tels que le glycérol-3-phosphate déshydrogénase mitochondriale et la proline déshydrogénase représentent des voies alternatives pour l’entrée des électrons dans les ETS^20,21. Ces complexes « alternatives » sont particulièrement importantes chez les insectes, comme selon les espèces, ils peuvent participer activement afin d’augmenter la respiration^20,22,23,21. Électrons de ces ETS systèmes d’alimentation sont transférés à l’ubiquinone et par la suite au complexe III, puis à complexe IV, jusqu’à ce que l’accepteur final, l’oxygène moléculaire. Ce transfert d’électrons génère une force proton-motrice à travers la membrane mitochondriale interne conduite la phosphorylation de l’ADP en ATP au complexe V (Figure 1). Considérant le rôle central des mitochondries dans l’homéostasie de la cellule, étudier le métabolisme mitochondrial en utilisant le modèle pertinent d. melanogaster représente un outil puissant pour délimiter les mécanismes sous-jacents de divers physiopathologiques conditions ou soumis à des contraintes environnementales et cellulaires. Curieusement cependant, seulement une poignée d’études réellement mesurées la respiration mitochondriale dans drosophile^24,25,26. En effet, les expériences visant à évaluer la consommation d’oxygène mitochondriale exigent l’isolement des mitochondries. Même si c’est avantageux pour la mesure des différentes fonctions mitochondriales (telles que la production de ROS ou ratio P/O comme marqueur mitochondrial efficacité^27,28), ces cas requièrent généralement assez grandes quantités des tissus provenant de plusieurs individus^24,29. Cette exigence de grandes quantités de tissus et d’individus est un facteur limitant important, surtout si l’on considère que tous les individus soient du même âge et de préférence du même sexe pour les expériences, faire de la mesure de la respiration à différents temps pointe laborieux au mieux. En outre, alors que des isolations mitochondriales peuvent fournir la perspicacité significative sur les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme mitochondrial, les méthodes utilisées pour isoler les mitochondries ont plusieurs inconvénients tels que la difficulté d’obtenir des résultats reproductibles , perturbation du réseau mitochondrial et altération mitochondriale structure et la fonction^29,30,31.

Le but de cette étude est de présenter un protocole robuste pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile en utilisant seulement une quantité minimale de tissu de très peu d’individus. Ce protocole consiste à mesurer l’oxygène mitochondriale consommation in situ utilisant des fibres musculaires perméabilisées²⁹ de thoraxes de la drosophile en combinaison avec haute résolution respirométrie^{32,33, 34 , 35}. cette méthode a également des avantages supplémentaires par rapport à la méthode d’isolement mitochondrial classique étant donné que les interactions avec les autres composants de la cellule aussi bien comme mitochondriale de structure et de fonction sont plus préservés dans perméabilisées fibres^29,31,36, qui rend cette approche plus physiologiquement pertinents. Avec ce protocole, fonctions mitochondriales peuvent être précisément évaluées à l’aide de respirométrie haute résolution en seulement trois thoraxes de la drosophile, avec des substrats permettant la détermination de la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS. Par conséquent, ce protocole pourrait aider à répondre à des questions clés sur les mécanismes fondamentaux qui contrôlent le métabolisme dans le cadre de nombreuses conditions environnementales ou pathophysiologiques en tirant parti du modèle drosophile.

Pour mesurer la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS et évaluer comment différents substrats contribuent à la respiration, les différents substrats (Figure 1), les découpleur et inhibiteurs sont utilisés³⁰ Après perméabilisation de la tissus. Plus précisément, ajouts séquentielles de différents substrats sont effectuées afin de stimuler l’entrée des électrons à travers différents complexes de l’ETS. Un découpleur, carbonyl cyanide 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), est alors ajouté à une concentration optimale pour mesurer la respiration non couplés, c’est-à-dire la respiration non-phosphorylation stimulée à consommation maximale d’oxygène. Inhibitions séquentielles des complexes qu’i, II et III sommes ensuite effectuée afin de surveiller la consommation d’oxygène résiduel qui est due à des réactions d’oxydation non-ETS. Enfin, capacité de respiration maximale complexe IV peut être évaluée par l’injection de N, N, N «, N, – tétraméthyl – p-phénylènediamine (TMPD), un fournisseur d’électrons artificiels et l’ascorbate. Il est important de noter que les expériences sont menées à 24 °C, puisque c’est la température à laquelle les mouches sont déclenchés.

Protocol

1. préparation de réactifs Préparer les solutions suivantes pour la dissection et la perméabilisation du tissu. Préparer la solution de préservation : 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM phosphocréatine de2Na, imidazole de 20 mM, 0,5 mM dithiothréitol et 50 mM K-MES, pH 7.1 (peut être conservée à-20 ° C). Préparer la solution de saponine : 5 mg de saponine dans 1 mL de solution…

Representative Results

Une trace représentative de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant le protocole décrit ci-dessus est fournie à la Figure 2. Le pyruvate et le malate injecté dans les chambres ainsi que les fibres musculaires perméabilisées sont désignés à la respiration CI-fuite, c’est-à-direlorsque le complexe I de l’ETS est stimulée par le NADH produit par oxydation du pyruvate et le malate via le cycle des acides tricarboxyliques (CI…

Discussion

Dans cette étude, on décrit une méthode pour la préparation de l’échantillon avant la mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile. Cette méthode a été développée pour résoudre les différents problèmes liés aux protocoles utilisant des isolations mitochondriales, notamment en termes de durée et nombre de personnes requis. Au lieu de travailler avec des isolations mitochondriales habituellement nécessitant une grande quantité de tissus obtenus à partir de plusieurs individus…

Materials

High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Fine-tipped antimagnetic forceps	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Goettingen, Germany		Semi-micro balance (distributed by several companies)
Drosophila melanogaster wild-type w1118	Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA		Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA Storage Condition: RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	Storage Condition: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Storage Condition: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	Storage Condition: -20 °C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	Storage Condition: RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark	Sigma-Aldrich	S7900	Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	Storage Condition: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	Storage Condition: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Storage Condition: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A5285	ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C7752	Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380	Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378	Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt	Sigma-Aldrich	G7886	Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid	Sigma-Aldrich	M1296	Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.  Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.