Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies
Summary
Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.
Abstract
Manipulation sélective des sous-populations de neurones spinale réalisée principalement par deux méthodes différentes : 1) génétique intersectionnelle, auquel cas doubles ou triples les souris transgéniques sont générés afin d’obtenir une expression sélective d’un journaliste ou un effecteur gène (par exemple, du locus Rosa26) dans la population souhaitée de la colonne vertébrale. 2) intrarachidienne de virus adeno-associé de recombinante de Cre-dépendante (rAAV) ; ici, des vecteurs d’AAV Cre-dépendante codant pour le gène reporter ou effecteur de choix sont injectées dans la moelle épinière des souris exprimant la recombinase Cre dans la sous-population neuronale désirée. Ce protocole décrit comment générer des vecteurs rAAV Cre-dépendante et comment transmettre les neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire segments L3-L5 avec rAAVs. Comme les segments de la colonne vertébrale lombaires L3-L5 sont innervés par ces neurones sensoriels périphériques qui transmettent l’information sensorielle provenant des membres postérieurs, comportement spontané et réponses à des tests sensoriels, appliqués pour le postérieur homolatéral du côté d’injection peuvent être analysées afin d’interroger la fonction des neurones manipulés de traitement sensoriel. Nous fournissons des exemples de comment cette technique peut être utilisée pour analyser génétiquement définies des sous-ensembles des neurones spinaux. Les principaux avantages d’expression du transgène induite par le virus chez les souris transgéniques Cre par rapport à l’expression classique journaliste induite par la souris transgénique sont les suivants : 1) rAAVs Cre-dépendante différents codant des protéines différentes de reporter ou d’effecteur peut être injecté dans une seule lignée transgénique Cre, surmontant ainsi la nécessité de créer plusieurs souris transgénique plusieurs lignes. 2) intrarachidienne limite manipulation de cellules exprimant le Cre au site d’injection et à l’heure après l’injection. Les inconvénients principaux sont : 1) expression du gène rapporteur de rAAVs est plus variable. 2) chirurgie est nécessaire pour transmettre les neurones spinaux d’intérêt. Laquelle des deux méthodes est la plus appropriée dépend de la question de population et de la recherche de neurone à traiter.
Introduction
La moelle épinière dorsale est essentielle pour l’échange d’informations entre la périphérie du corps et le cerveau. Des stimuli sensoriels comme la chaleur, le froid, le toucher, ou des stimuli nociceptifs sont détectés par les neurones périphériques spécialisés, qui transmettent cette information aux neurones de la corne dorsale de la moelle épinière. Ici, un réseau complexe des interneurones inhibiteurs et excitateurs module et finit par relais l’information sensorielle par l’intermédiaire des neurones spinaux projection supraspinales sites1,2. Les calculs effectués par la moelle inter- et neurones de projection porte l’information sensorielle, ainsi déterminer quelle information est supprimée ou relayée à quelle intensité. Changements dans l’intégration des stimuli sensoriels, comme un équilibre altéré entre l’inhibition et excitation, peuvent provoquer des dysfonctionnements sensoriels tels que l’hypersensibilité ou allodynie (sensations douloureuses après une stimulation normalement non douloureuse). Ces changements sont considérés comme la cause sous-jacente de la douleur chronique divers États3,4. Ainsi, les circuits spinaux sont d’une grande importance au traitement sensoriel et par conséquent dans la perception de l’environnement de l’organisme et soi. Avec l’avènement récent et combinaison de moléculaire, génétique et des techniques chirurgicales qui permettent la manipulation précise de sous-populations génétiquement identifiés neurone spinal, les scientifiques commencent à comprendre les circuits de la colonne vertébrale sous-jacente responsable du traitement des différentes modalités sensorielles.
Intrarachidienne de rAAV chez des souris transgéniques ou de type sauvage a grandement contribué à la manipulation, l’analyse et la compréhension de la fonction des sous-ensembles spécifiques de neurones spinaux5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. cette technique permet la livraison de protéines marqueur (tels que GFP / protéines de fusion de GFP), protéines de journaliste (comme GCaMP), ou protéines effectrices (tels que les toxines bactériennes, channelrhodopsin ou récepteurs pharmacogénétiques) dans un spatialement manière limitée aux neurones spinaux. Injection locale de rAAVs Cre-dépendante dans des souris transgéniques exprimant une recombinase Cre dans un sous-ensemble spécifique des neurones spinaux permet l’analyse spécifique de la population neuronale respectif. Nous avons utilisé cette technique pour étiqueter, ablation, inhiber ou activer la colonne vertébrale glycinergic neurones démontrant qu’ils sont une partie essentielle de la porte de la colonne vertébrale contrôler la douleur et démangent transmission7. Dans ces expériences, intrarachidienne de Cre-dépendant du rAAV GlyT2::Cre chez la souris a permis la manipulation sélective des neurones glycinergic dans la moelle lombaire. Ainsi, la manipulation simultanée des circuits supraspinal qui contiennent glycinergic neurones essentiels à la survie de l’animal peut être évitée.
Alors que l’administration intrarachidienne de rAAVs limite infection au site d’injection, transduction virale peut se produire non seulement dans les neurones les, mais aussi dans les neurones qui se connectent au site d’injection via projections axonales. Ce dernier est souvent utilisé pour les zones de CNS trace apport neuronale d’un noyau particulier dans le cerveau. L’infection des projections axonales possible, toutefois, également être un facteur de confusion quand une population définie de neurones doit être étudiée dans un site donné. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment effectué une analyse complète des sérotypes d’AAV et cassettes d’expression pour identifier des sérotypes et des promoteurs qui peuvent servir à minimiser ou maximiser transduction rétrograde. Dans le cadre de cette recherche spécifique dans les circuits de la colonne vertébrale, nous avons analysé la capacité des promoteurs et des sérotypes différents de transduce marqués des neurones dans le cortex somatosensoriel les ganglions de la racine dorsale (GRD) et la moelle ventro rostrale (RVM) 12. la technique décrite dans le présent protocole peut donc servir à analyser les neurones spinaux au site d’injection ou d’analyser des neurones de projection que formuler des commentaires sur le site d’injection de la moelle épinière. Dans le protocole décrit ici, trois injections du rAAV dans le côté gauche de la colonne vertébrale lombaire sont réalisées pour permettre la transduction des neurones dans les trois segments lombaires (L3-L5). Les segments de L3-L5 reçoivent la majorité de l’information sensorielle du postérieur homolatéral au site d’injection. Nous démontrons que la manipulation fonctionnelle des neurones génétiquement marquées en L3-L5 est suffisante pour susciter des changements de comportement robustes, fournissant ainsi la preuve fonctionnelle pour la fonction de circuit de telle un sous-type de neurone génétiquement marquées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intrarachidienne de AAVs peut devenir une technique puissante dans un laboratoire de recherche, qui permet l’analyse des cellules de la colonne vertébrale avec une solution spatiale et temporelle élevée. Ce protocole permet la transduction des trois segments spinaux principales innervés par des neurones sensoriels s’étendant leurs axones périphériques aux membres postérieurs. Transduction de trois segments produit des données comportementales robustes et reproductibles. Il permet aussi l’essai d’une plus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Hanns Ulrich Zeilhofer pour soutenir généreusement ce travail. Hendrik Wildner a été soutenu par la Fondation Olga Mayenfisch. Nous remercions l’anticorps Lmx1b Carmen Birchmeier.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
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