Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel
Summary
Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.
Abstract
Live-cel imaging is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om direct het visualiseren van biologische fenomenen in afzonderlijke cellen gedurende langere perioden van tijd. In het afgelopen decennium, hebben nieuwe en innovatieve technologieën aanzienlijk verbeterd de uitvoerbaarheid voor live-cel imaging. Cellen kunnen nu worden gehouden in focus en continu beeld over meerdere dagen terwijl onderhouden onder 37 °C en 5% CO2 cel cultuuromstandigheden. Bovendien kunnen meerdere velden van weergave waarin verschillende experimentele omstandigheden worden verworven gelijktijdig, waardoor hoge gegevensdoorvoer experimentele gegevens. Live-cel imaging biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van vaste-cel imaging doordat voor de directe visualisatie en temporele kwantificatie van dynamische cellulaire gebeurtenissen. Live-cel imaging herkent ook variatie in het gedrag van afzonderlijke cellen die anders zouden hebben is gemist met behulp van bevolking gebaseerde testen. Hier beschrijven we live-cel imaging protocollen voor de beoordeling van de cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel. We tonen aan methoden om te visualiseren of mitotically cellen sterven rechtstreeks aan de mitose of slip terug in interfase gearresteerd. Ook beschrijven we hoe de fluorescerende ubiquitination gebaseerde celcyclus indicator (FUCCI) systeem kan worden gebruikt om te beoordelen van de Fractie van de interfase cellen geboren uit mitotische ontsporing die kunnen de celcyclus opnieuw in te voeren. Ten slotte, beschrijven we een live-cell, beeldvorming methode ter identificatie van de nucleaire envelop breuk gebeurtenissen.
Introduction
Anti-mitotische drugs hebben al lange tijd gebruikt in de chemotherapeutische regimes van verschillende soorten van stevige tumors en tonen vaak grote werkzaamheid1,2,3. Mechanistically, deze drugs verstoren de normale mitotische progressie en bevordering van de mitotische arrestatie in snel prolifererende kankercellen. Lot van de cel in reactie op de mitotische arrestatie is echter zeer variabel: terwijl een deel van de cellen de dood van de cel rechtstreeks vanuit de mitose ondergaat, anderen afsluiten van mitose en terugkeer naar de interfase als tetraploïde cellen (een proces genoemd mitotische ontsporing)4, 5,6,7,8. Deze interfase cellen kunnen uitvoeren van apoptosis, permanente celcyclus arrestatie ondergaan, of zelfs opnieuw invoeren van de celcyclus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Cellen die mitotische celdood te omzeilen door zich te glijden in de interfase, alleen tot Re-Enter de celcyclus na verwijdering van de drug, kunnen dus bijdragen aan de re-opkomst van kanker-cel populaties. Bovendien, terugvalpreventie cellen dat slip van mitose tetraploïde, en tetraploidy bekend is ter bevordering van chromosoom instabiliteit die tumor drijft12,13,14,15. Vaststelling van de factoren waarmee de cel lot in reactie op anti-mitotische drug behandelingen is daarom cruciaal te optimaliseren van huidige therapeutics.
In dit protocol beschrijven we methoden om rechtstreeks observeren en studie van het lot van cellen die langdurige mitotische arrestatie in reactie op de anti-mitotische drug paclitaxel ondergaan. Paclitaxel is een gevestigde therapeutisch in de kliniek en heeft bewezen zeer doeltreffend in vele soorten van tumoren, met inbegrip van die van de borst, eierstokken en longen16,17,18,19, 20. Paclitaxel, oftewel een plant alkaloïde afkomstig van de schors van de boom van de taxus, microtubuli stabiliseert en aldus verhindert hun dynamicity21,22. Terwijl demping van microtubulus dynamiek door paclitaxel heeft geen invloed op de celcyclus van G1 t/m G2, leidt de drug tot aanhoudende activatie van de spindel vergadering checkpoint tijdens de mitose door belemmeren Kinetochoor-microtubulus bijlage (herzien in diepte hier23,24)25. Dientengevolge, anafase begin voorkomen in cellen paclitaxel-behandeld en resultaten in een langdurige mitotische arrestatie.
Dit protocol zal eerst beschrijven benaderingen ter identificatie van de mitotische cellen in live-cel imaging experimenten. Mitose kan worden gevisualiseerd in aanhangend weefselkweek cellen als gevolg van twee merkbaar cel biologische veranderingen. Chromosomen worden eerst zeer gecondenseerd onmiddellijk voorafgaand aan de nucleaire envelop verdeling. Terwijl vaak aantoonbaar met standaard fase contrast microscopie, kan chromosoom condensatie worden duidelijker opgespoord met behulp van fluorescerende labels die label chromosomen (bijvoorbeeld fluorescently-geëtiketteerden Histon eiwitten). Tweede, mitotische cellen kunnen ook worden geïdentificeerd door de grote morfologische veranderingen die uit de cel afronding voortvloeien.
Dit protocol demonstreer dan het gebruik van live-cel imaging benaderingen voor het bijhouden van het lot van cellen ervaren langdurige mitotische arrestatie. Cellen gearresteerd in de mitose ondergaan een van drie verschillende lot. Ten eerste kunnen cellen celdood tijdens de mitose ondergaan. Dit fenomeen is gemakkelijk gevisualiseerd door de lichte microscopie, zoals stervende cellen worden waargenomen verschrompelen, bleb, en/of breuk. Ten tweede, cellen kunnen afsluiten van mitose en ga terug naar de interfase zonder chromosoom segregatie of cytokinese, een proces genoemd mitotische ontsporing. De decondensation van chromosomen en/of de afvlakking van de mitotische cel gemakkelijk identificeert dit proces. Cellen die van mitose ontaarden ook vaak weer onregelmatig, multi Gelobde kernen en vaak haven verschillende micronuclei5. Ten derde kunnen cellen gearresteerd in de mitose initiëren van anafase en ga door mitose na een lange onderbreking. Terwijl ongebruikelijk bij hogere concentraties van de drug, suggereert dit probleem dat de gearresteerde cellen de spindel vergadering controlepost kunnen hebben voldaan, of dat de spindel vergadering checkpoint is gedeeltelijk verzwakte of defect. Anafase begin kan worden gevisualiseerd door chromosoom segregatie en latere cytokinese met behulp van live-cel imaging.
Live-cel beeldvormende methoden voor het bijhouden van het lot van cellen die mitotische celdood te omzeilen door zich te ondergaan mitotische ontsporing zal ook worden beschreven. Cellen die u ondergaan mitotische ontsporing sterven in de daaropvolgende interfase, leiden tot een duurzaam G1 celcyclus arrestatie of de celcyclus om te starten van een nieuwe ronde van celdeling4opnieuw in te voeren. Een aanpak met behulp van de FUCCI (fluorescerende ubiquitination gebaseerde celcyclus indicator) systeem om te bepalen van de Fractie van cellen die opnieuw invoeren van de celcyclus na mitotische ontsporing zal worden beschreven. FUCCI zorgt voor de directe visualisatie van de G1/s overgang en kan worden gebruikt in combinatie met op lange termijn live-cel imaging zowel in vitro als in vivo26,27. Het FUCCI-systeem maakt gebruik van twee fluorescently geëtiketteerde proteïnen, afgeknotte vormen van hCdt1 (chromatine licenties en DNA-replicatie factor 1) en hGeminin, waarvan niveaus schommelen op basis van de positie van de celcyclus. hCdt1 (gesmolten aan een rode fluorescent proteïne) is aanwezig op een hoog niveau tijdens G1 fase waar het handelt om te licentie van DNA voor replicatie, maar is ubiquitinated door de ligase E3 ubiquitin SCFSkp2 en gedegradeerd tijdens S/G2/M fasen om te voorkomen dat opnieuw replicatie van DNA26. Daarentegen, hGeminin (gesmolten aan een groen fluorescent proteïne), is een inhibitor van hCdt1 waarvan piek niveaus tijdens S/G2/M, maar is van ubiquitinated door de E3 ubiquitin ligase APCCdh1 en afgebroken aan het einde van de mitose en hele G1 26. dus, FUCCI levert een eenvoudige fluorescentie uitlezing van de fase van de celcyclus, zoals cellen rode fluorescentie tijdens G1, en groen fluorescentie tijdens S/G2/M vertonen. Het FUCCI systeem is een belangrijke stap vooruit over andere benaderingen (zoals bromodeoxyuridine kleuring) te identificeren, proliferatieve cellen, omdat het vereist geen cel fixatie en voor eencellige imaging zonder de behoefte aan extra zorgt farmacologische behandelingen voor het synchroniseren van cel populaties. Hoewel niet besproken in dit protocol, zijn er extra live-cel sensoren ook ontwikkeld om te visualiseren celcyclus, met inbegrip van een helicase B sensor voor G128, DNA ligase-RFP29 en PCDNA-GFP30 sensoren voor de S-fase, en de recente FUCCI-4-sensor, die detecteert alle stadia van de celcyclus31.
Tot slot zal een live-cel beeldvorming methode detecteren nucleaire envelop breuk worden beschreven. Recente studies is gebleken dat de nucleaire enveloppen van kankercellen zijn instabiel en gevoelig voor barsten, waardoor de inhoud van de nucleoplasm en het cytoplasma aan intermix. Dit verschijnsel, nucleaire breuk, genoemd kan bevorderen DNA-beschadiging en stimulatie van de ingeboren immune reactie32,33,34,35,,36,,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. terwijl de onderliggende oorzaken van nucleaire breuk onvolledig gekarakteriseerd blijven, het is bekend dat de vervormingen in nucleaire structuur met een verhoogde incidentie van nucleaire breuk42correleren. Een bekende effect van paclitaxel behandeling is de generatie van opvallend abnormale nucleaire structuren na mitose; als zodanig worden een methode met behulp van live-cel imaging te kwantificeren van nucleaire breuk beschreven, terwijl het ook onderzoeken als paclitaxel behandeling de frequentie van nucleaire breuk gebeurtenissen verhoogt. Nucleaire breuk kan worden gedetecteerd door de waargenomen lekkage van een nucleaire-gerichte fluorescent proteïne in het cytoplasma (b.v. een tandem-dimeer herhaling van RFP gesmolten in een nucleaire localisatie signaal, TDRFP-NLS). Deze lekkage is duidelijk zichtbaar met het blote oog, waarmee eenvoudige kwantificatie van breuk gebeurtenissen.
Dit protocol vereist een widefield epifluorescence Microscoop die is uitgerust met een gecodeerde podium en autofocus software. De gecodeerde fase zorgt voor nauwkeurige automatische beweging naar gedefinieerde X-en Y-coördinaten, terwijl autofocus software cellen in focus voor de duur van de beeldvorming handhaaft. Bovendien, dit protocol vereist dat apparatuur om cellen bij 37 ° C met 5% CO2 bevochtigde sfeer. Dit kan worden bereikt door de gehele Microscoop binnen een temperatuur en sfeer gecontroleerd behuizing, of met behulp van fase-top apparaten dat lokaal onderhoudt temperatuur en milieu. Het doel van de fase contrast gebruikt in dit protocol is een plan fluor 10 x met een numerieke diafragma van 0.30. 20 X doelstellingen zijn echter ook voldoende beide afgeronde mitotische en afgevlakte interfase cellen in een enkele brandvlak worden geïdentificeerd. Het uitvoeren van fase-contrast kunnen imaging (zoals beschreven in deze methode), de cover glas of kunststof. Als differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie wordt gebruikt, is het noodzakelijk een glasdeel gebruiken om te voorkomen dat depolarisatie van licht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het meest kritieke aspect voor lange termijn live-cel imaging is het waarborgen van de gezondheid van de cellen wordt beeld. Het is essentieel dat de cellen worden blootgesteld aan minimale vreemde milieustressoren, zoals ondermaatse omstandigheden ten aanzien van temperatuur, vochtigheid en/of CO2 niveaus. Het is ook belangrijk om te beperken photodamage van fluorescerende excitatie verlichting, zoals imaging stress is bekend dat het invloed op cel gedrag50. Beperking van photodamage k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV en NJG bedank Ryan Quinton voor opmerkingen over de manuscript en Adrian Salische voor de TDRFP-NLS-construct. AFB en MAV worden gefinancierd door de NIGMS biomoleculaire farmacologie opleiding Grant 5T32GM008541. NJG is een lid van de Shamim en Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories en wordt ondersteund door de NIH subsidies GM117150 en CA-154531, de Karin Grunebaum Foundation, het Smith familie Awards programma, het programma van de geleerden Searle en het melanoom-onderzoek Alliance.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
References
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
- Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?. Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
- Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
- Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
- Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
- Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
- Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
- McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
- McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
- Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
- Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
- Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
- Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
- Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
- Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
- Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
- Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
- Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
- Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
- Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
- de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
- Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
- Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
- Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug?. Open Biol. 7 (11), (2017).
- Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
- Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
- Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
- Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
- Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
- Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
- Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
- Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).
