लंबे समय तक रहते सेल इमेजिंग Paclitaxel के जवाब में सेल भाग्य का आकलन करने के लिए
Summary
लाइव सेल इमेजिंग एकल कोशिकाओं या पूरी आबादी है कि तय सेल इमेजिंग अकेले द्वारा अप्राप्य है पर जानकारी का खजाना प्रदान करता है । यहां, लाइव सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल विरोधी mitotic दवा paclitaxel के साथ उपचार के बाद सेल भाग्य निर्णय का आकलन करने के लिए वर्णित हैं ।
Abstract
Live-सेल इमेजिंग एक शक्तिशाली तकनीक है कि सीधे समय की विस्तारित अवधि में एकल कोशिकाओं में जैविक घटना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले एक दशक में, नई और अभिनव प्रौद्योगिकियों ने बहुत से लाइव सेल इमेजिंग की व्यावहारिकता को बढ़ाया है । कोशिकाओं को अब ध्यान में रखा जा सकता है और लगातार कई दिनों से छवि बनाई है, जबकि ३७ डिग्रीसेल्सियस और 5% सह2 सेल संस्कृति की स्थिति के तहत बनाए रखा । इसके अलावा, विभिंन प्रयोगात्मक स्थितियों का प्रतिनिधित्व देखने के कई क्षेत्रों एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार उच्च प्रवाह प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करते हैं । लाइव सेल इमेजिंग प्रत्यक्ष दृश्य और गतिशील सेलुलर घटनाओं के लौकिक quantitation के लिए अनुमति देकर फिक्स्ड सेल इमेजिंग पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । लाइव सेल इमेजिंग भी एकल कोशिकाओं है कि अंयथा जनसंख्या का उपयोग कर याद किया गया होगा के व्यवहार में भिंनता की पहचान कर सकते है आधारित परख । यहां, हम लाइव सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सेल भाग्य विरोधी mitotic दवा paclitaxel के साथ उपचार के बाद निर्णय का आकलन । हम तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए कल्पना है कि क्या mitotically गिरफ्तार कोशिकाओं बँटवारा से सीधे मर जाते हैं या चरण में वापस पर्ची. हम यह भी वर्णन कैसे फ्लोरोसेंट ubiquitination आधारित कोशिका चक्र संकेतक (FUCCI) प्रणाली के लिए mitotic फिसलन है कि फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने में सक्षम है से पैदा चरण कोशिकाओं के अंश का आकलन किया जा सकता है । अंत में, हम एक जीवित सेल इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए परमाणु लिफाफा टूटना घटनाओं की पहचान ।
Introduction
विरोधी mitotic दवाओं लंबे ठोस ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के कीमोथेरेपी परहेजों में इस्तेमाल किया गया है और अक्सर महान प्रभावकारिता1,2,3दिखा । Mechanistically, ये दवाएं सामान्य mitotic प्रगति को बाधित करती हैं और तेजी से proliferating कैंसर कोशिकाओं में mitotic गिरफ्तारी को बढ़ावा देती हैं । हालांकि, mitotic गिरफ्तारी के जवाब में सेल भाग्य अत्यधिक चर रहा है: जबकि कोशिकाओं का एक अंश बँटवारा से सीधे कोशिका मृत्यु हो जाती है, दूसरों के बँटवारा से बाहर निकलें और tetraploid कोशिकाओं के रूप में एक चरण में वापसी (एक प्रक्रिया mitotic फिसल)4, 5,6,7,8. इन चरण कोशिकाओं apoptosis निष्पादित कर सकते हैं, स्थायी सेल चक्र की गिरफ्तारी से गुजरना, या यहां तक कि सेल चक्र4,5,6,7,8,9 ,10,11. कोशिकाओं है कि चरण में फिसल द्वारा mitotic सेल मौत से बचने, केवल फिर से दवा हटाने के बाद सेल चक्र में प्रवेश करने के लिए, इसलिए कैंसर सेल आबादी के फिर से उभरने में योगदान कर सकते हैं । इसके अलावा, कोशिकाओं है कि बँटवारा से पर्ची tetraploid हैं, और tetraploidy गुणसूत्र अस्थिरता को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है कि ड्राइव ट्यूमर पलटा12,13,14,15. कारकों को परिभाषित करने कि विरोधी mitotic दवा उपचार के जवाब में सेल भाग्य नियंत्रण इसलिए वर्तमान चिकित्सकीय अनुकूलन महत्वपूर्ण है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम तरीकों का वर्णन करने के लिए सीधे निरीक्षण और कोशिकाओं है कि विरोधी mitotic दवा paclitaxel के जवाब में लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी से गुजरना के भाग्य का अध्ययन । Paclitaxel क्लिनिक में एक स्थापित चिकित्सीय है और कई ट्यूमर प्रकार, स्तन, अंडाशय, और फेफड़ों के उन सहित में अत्यधिक प्रभावोत्पादक साबित कर दिया है16,17,18,19, 20. Paclitaxel, जो Yew पेड़ की छाल से व्युत्पंन एक संयंत्र उपक्षार है, microtubules स्थिर और इस प्रकार उनके गतिशीलता रोकता है21,22। जबकि paclitaxel द्वारा microtubule गतिशीलता के भीगा जी 2 के माध्यम से1 से सेल चक्र प्रगति को प्रभावित नहीं करता है, दवा बाधा द्वारा बँटवारा के दौरान धुरी विधानसभा चौकी के निरंतर सक्रियण के लिए नेतृत्व करता है kinetochore-microtubule अनुलग्नक (गहराई में समीक्षा की यहां23,24)25। एक परिणाम के रूप में, anaphase शुरुआत paclitaxel-इलाज कोशिकाओं और एक लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी में परिणाम में रोका जाता है ।
यह प्रोटोकॉल पहले live-सेल इमेजिंग प्रयोगों में mitotic कोशिकाओं की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे । बँटवारा दो नजर कोशिका जैविक परिवर्तनों के कारण अनुयाई टिशू कल्चर की कोशिकाओं में visualized किया जा सकता है. पहला, गुणसूत्रों परमाणु लिफाफा टूटने से तुरंत पहले अत्यधिक गाढ़ा हो जाते हैं । जबकि अक्सर मानक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable, गुणसूत्र संघनित्र और अधिक स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग कर पाया जा सकता है कि लेबल गुणसूत्रों (जैसे फ्लोरोसेंट-लेबल हिस्टोन प्रोटीन) । दूसरा, mitotic कोशिकाओं को भी नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन है कि सेल गोलाई से परिणाम द्वारा पहचाना जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल तो कैसे रहते सेल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी का अनुभव कोशिकाओं के भाग्य ट्रैक प्रदर्शित करेगा । कोशिकाओं का बँटवारा में गिरफ्तार तीन अलग किस्मत में से एक से गुजरना. सबसे पहले, कोशिकाओं बँटवारा के दौरान कोशिका मृत्यु से गुजरना कर सकते हैं. इस घटना को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized है, के रूप में मर कोशिकाओं को सिकोड़ें, bleb, और/ दूसरा, कोशिकाओं बँटवारा से बाहर निकलें और गुणसूत्र अलगाव या cytokinesis, एक प्रक्रिया mitotic फिसल के बिना चरण के लिए वापस लौट सकते हैं । गुणसूत्रों और/या mitotic सेल के समतल को आसानी से इस प्रक्रिया की पहचान करता है । बँटवारा से निकलने वाली कोशिकाएँ भी प्रायः अनियमित, बहु-पालिक नाभिक और बहुधा हार्बर कई micronuclei5प्रदर्शित करते हैं. तीसरे, बँटवारा में पकडे गए कक्ष anaphase आरंभ कर सकते हैं और एक लंबे विलंब के बाद बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ें. जबकि उच्च दवा सांद्रता पर असामांय, इस व्यवहार से पता चलता है कि गिरफ्तार कोशिकाओं धुरी विधानसभा चौकी, या कि धुरी विधानसभा चौकी आंशिक रूप से कमजोर या दोषपूर्ण है संतुष्ट हो सकता है । Anaphase शुरुआत गुणसूत्र अलगाव और बाद cytokinesis लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करके visualized किया जा सकता है ।
लाइव सेल इमेजिंग तरीके कोशिकाओं है कि से बचने के भाग्य को ट्रैक करने के लिए mitotic कोशिका मृत्यु से गुजरना mitotic फिसलन भी बताई जाएगी । कोशिकाओं है कि mitotic फिसलन से गुजरना या तो बाद के दौर में मर जाते हैं, एक टिकाऊ जी1 सेल चक्र गिरफ्तारी ट्रिगर, या सेल चक्र के फिर से प्रवेश के लिए सेल डिवीजन4के एक नए दौर शुरू करते हैं । FUCCI (फ्लोरोसेंट ubiquitination-आधारित कोशिका चक्र संकेतक) प्रणाली का उपयोग कर कोशिकाओं के अंश का निर्धारण करने के लिए एक दृष्टिकोण है कि फिर से mitotic फिसलन निंनलिखित सेल चक्र में प्रवेश का वर्णन किया जाएगा । FUCCI G1//संक्रमण के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है और लंबी अवधि के लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में दोनों में और vivo26,27में इस्तेमाल किया जा सकता है । FUCCI प्रणाली दो फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन का लाभ लेता है, hCdt1 के छोटे रूपों (क्रोमेटिन लाइसेंस और डीएनए प्रतिकृति कारक 1) और hGeminin, जिसका स्तर कोशिका चक्र की स्थिति के आधार पर दोलन । hCdt1 (एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए) जी1 चरण के दौरान उच्च स्तर पर मौजूद है, जहां यह प्रतिकृति के लिए डीएनए लाइसेंस के लिए कार्य करता है, लेकिन E3 ubiquitin ligase एससीएफSkp2 द्वारा ubiquitinated है और S/जी के दौरान नीचा2/M चरणों को रोकने के लिए डीएनए की पुन: प्रतिकृति26. इसके विपरीत, hGeminin (एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए), hCdt1 के एक अवरोध करनेवाला है, जिसका स्तर एस के दौरान चोटी2/M, लेकिन E3 ubiquitin ligase APCCdh1 द्वारा ubiquitinated है और बँटवारा के अंत में नीचा और जी1 भर में 26. नतीजतन, FUCCI कोशिका चक्र चरण का एक सीधा प्रतिदीप्ति readout बचाता है, के रूप में कोशिकाओं के दौरान जी1, और ग्रीन प्रतिदीप्ति के दौरान लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन S/2/M. FUCCI प्रणाली अंय दृष्टिकोण पर एक महत्वपूर्ण अग्रिम है (जैसे bromodeoxyuridine धुंधला) प्रफलन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, क्योंकि यह सेल निर्धारण की आवश्यकता नहीं है और अतिरिक्त औषधीय के लिए की आवश्यकता के बिना एकल सेल इमेजिंग के लिए अनुमति देता है कोशिका आबादी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए उपचार. हालांकि इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं, अतिरिक्त रहते सेल सेंसर भी सेल चक्र प्रगति कल्पना, जी128, डीएनए ligase-आरएफपी29 और PCDNA-GFP30 सेंसर के लिए एक helicase बी सेंसर सहित विकसित किया गया है एस चरण के लिए, और हाल ही में FUCCI-4 सेंसर, जो सेल चक्र के सभी चरणों का पता लगाता है31.
अंत में, परमाणु लिफाफा टूटना का पता लगाने के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग विधि वर्णित किया जाएगा । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कैंसर कोशिकाओं के परमाणु लिफाफे अस्थिर और फटने की संभावना है, जिससे nucleoplasm और कोशिका द्रव्य की सामग्री intermix करने की अनुमति है । इस घटना, परमाणु टूटना करार, डीएनए क्षति और जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया३२,३३,३४,३५,३६,३७, की उत्तेजना को बढ़ावा कर सकते है ३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२ , ४३ , ४४. जबकि परमाणु टूटना के अंतर्निहित कारणों को पूरी तरह से लक्षण रहते हैं, यह ज्ञात है कि परमाणु संरचना में विकृति परमाणु टूटना४२की वृद्धि हुई घटनाओं के साथ सहसंबंधी बनाना । paclitaxel उपचार के एक प्रसिद्ध प्रभाव स्पष्ट रूप से असामान्य परमाणु संरचनाओं का बँटवारा के बाद की पीढ़ी है; जैसे, एक लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए परमाणु टूटना यों तो विधि का वर्णन किया जाएगा, जबकि भी तलाश अगर paclitaxel उपचार परमाणु टूटना घटनाओं की आवृत्ति बढ़ जाती है । परमाणु टूटना एक परमाणु के मनाया रिसाव से पता लगाया जा सकता कोशिका द्रव्य में फ्लोरोसेंट प्रोटीन लक्षित (एक मिलकर आरएफपी के एक मिलकर डिमर दोहराने के एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत करने के लिए जुड़े, TDRFP-एनएलएस) । यह रिसाव आंख, जो टूटना घटनाओं के सरल quantitation सक्षम बनाता है द्वारा अलग दिखाई है ।
इस प्रोटोकॉल एक widefield epifluorescence माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है कि एक इनकोडिंग मंच और फोकस सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित है । एनकोडेड अवस्था सटीक स्वचालित आंदोलन के लिए X-Y निर्देशांक परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है, जबकि स्वत focus सॉफ्टवेयर इमेजिंग अवधि की अवधि के लिए ध्यान में कोशिकाओं को बनाए रखता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल humidified 5% CO2 वातावरण के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए उपकरणों की आवश्यकता है । यह एक तापमान और वायुमंडल नियंत्रित बाड़े के भीतर पूरे माइक्रोस्कोप संलग्न द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या स्थानीय रूप से तापमान और पर्यावरण को बनाए रखता है कि स्टेज-टॉप उपकरणों का उपयोग करके. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त चरण-कंट्रास्ट उद्देश्य ०.३० की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ 10x fluor योजना है । हालांकि, 20X उद्देश्य भी एक ही फोकल विमान में दोनों गोल mitotic और चपटा चरण कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं । यदि चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग प्रदर्शन (जैसा कि इस विधि में वर्णित है), आवरण या तो कांच या प्लास्टिक हो सकता है । यदि विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) माइक्रोस्कोपी प्रयोग किया जाता है, यह प्रकाश के ध्रुवीकरण को रोकने के लिए एक गिलास कवर का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
लंबी अवधि के लाइव सेल इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा रहा है की कोशिकाओं के स्वास्थ्य की छवि है । यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को न्यूनतम बाहरी पर्यावरणीय तनावों को उजागर क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV और NJG को Salic-TDRFP के निर्माण के लिए पांडुलिपि और एड्रियन एनएलएस पर टिप्पणी के लिए रयान Quinton शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । AFB और MAV NIGMS आणविक औषध प्रशिक्षण अनुदान 5T32GM008541 द्वारा वित्त पोषित हैं. NJG शमीम और अशरफ दाहोद स्तन कैंसर अनुसंधान प्रयोगशालाओं के एक सदस्य है और NIH अनुदान GM117150 और सीए-१५४५३१, करीन Grunebaum फाउंडेशन, स्मिथ परिवार पुरस्कार कार्यक्रम, Searle विद्वानों कार्यक्रम, और मेलेनोमा अनुसंधान द्वारा समर्थित है एलायंस.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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