Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi
Summary
Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
Burada, kapsamlı üç boyutlu nöro-vasküler dallanma morfogenez ve desenlendirme yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım hücresel düzeyde eğitim için teknik görüntüleme bir bütün-mount yetişkin kulak deri bir iletişim kuralı mevcut. Periferik sinir ve damar anatomik yapıları yetişkin dokularda analizini bazı anlayışlar fonksiyonel nöro-vasküler kablolama ve patolojik durumlarda yara iyileşmesi gibi nöro-vasküler dejenerasyon anlayışı sunuyor. Son derece bilgilendirici modeli sistemi çalışmalarımız diseksiyon için kolay erişilebilir yetişkin kulak cilt üzerinde odaklanmıştır. Bizim basit ve tekrarlanabilir Protokolü (duyusal aksonlar, sempatik akson ve Schwann hücreleri) periferik sinirler, kan damarları (endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri gibi tüm cilt hücresel bileşenlerindeki doğru bir tasviri sağlar ) ve inflamatuar hücre. Bizce bu protokolü periferik sinirler ve kan damarları morfolojik anormallikleri yanı sıra farklı patolojik şartlar altında yetişkin kulak deride enflamasyon araştırmak için önünü açacak.
Introduction
Cilt üç katmandan oluşur: epidermis, dermis ve hypodermis. Bu kök hücre bakım, farklılaşma ve morfogenetik geliştirme gibi yeniden oluşturma işlemi, tumorigenesis ve inflamasyon yetişkin eğitim için bir model sistem olarak kullanılmıştır. Cilt zengin skarların ve periferik sinir sistemi ve damar sistemi gelişimi iyi koordine öyle ki innervated.
Biz daha önce olduğu gibi periferik sinirler ve kan damarları onların hücresel bileşenleri1,2,3, de dahil olmak üzere eğitim için birden çok etiket yapma ile bir bütün-mount embriyonik cilt görüntüleme tekniği göstermiştir 4: duyusal aksonlar, sempatik aksonlar, Schwann sinir hücrelerinde, endotel hücreleri, perisitlerden ve kan damarlarının damar düz kas hücrelerinde (VSMCs). Angiogenez sırasında birincil kapiller ağ yoğun vasküler remodeling uğrar ve hiyerarşik bir vasküler dallanma ağına geliştirir. Gelişmekte olan DermIS/hypodermis, arterler çevresel duyusal sinirler ve damarlar ile birlikte şube ardından arterler için bitişik form. Hiyerarşik damar ağı iyice VSMCs ile kapalı sonra sempatik sinirler boyunca genişletmek ve geniş çaplı kan damarları1,5,6innervate. Gelişmekte olan sinir ve damar sistemleri arasındaki yakın ilişki içinde önemini rağmen yetişkin çeşitli patolojik durumlarda nöro-vasküler ağlarda ne yönelik olarak önemli bir soru oldu. Üç boyutlu bir yüksek çözünürlüklü görüntü Patogenez, anatomik olarak tanınabilir dallanma morfogenez ve desenlendirme ile birlikte takdir etmek gereklidir.
Nöronal ve vasküler morfogenez yetişkin fare deride yaygın doku bölümü boyama tarafından analiz edilir. Diğer çalışmalar bütün Dağı görüntüleme deri periferik sinirler ve kan damarları, ek olarak saç folikülleri, yağ bezleri ve arrector pili kas7,8,9görselleştirmek için kullandık. Ancak, Yetişkin cilt kalınlığı deri tüm derinliği üzerinde analiz etmek zor yaptı.
Bu da çalışmanın, biz bu zorlukları aşmak için yetişkin kulak deri bir roman yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme geliştirdik. Kulak cilt üzerinde tüm derinliği diseksiyon ve sonraki bütün Dağı görüntüleme cilt için kolayca erişilebilir. Böylece, bu üç boyutlu mimari cilt kapsamlı miktar ölçümleri ile periferik sinir ve damar sistemlerinin karşılaştırmak için uygulanan bir basit ve son derece tekrarlanabilir yolu. Büyük çaplı kan damarları ile çevresel duyusal ve sempatik sinirler hizalamasını yetişkin cilt korunur gösterdi. Bu protokol dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları, aynı zamanda iltihabı gibi değişik koşullarda yetişkin fare modellerinde hücresel düzeyde bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek için hedeftir ve rejenerasyon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı nöro-vasküler yapılar ve bağışıklık hücre dağıtım analizi için yetişkin kulak derinin bütün-mount immunonohistochemical görüntüleme açıklar. İnanıyoruz Bu yöntem dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları desenlendirme, hem de bağışıklık hücreleri ve saç gibi cilt bileşenlerinin üç boyutlu dağıtım çalışmaya araştırmacılar için çok sayıda deneysel avantajları folikülleri. Görüntüleme sonuçlarını görüntüleme yazılımları kullan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K. Gill Laboratuvar Yönetimi için teşekkür ediyoruz ve fare Bakımı ve R. Reed konusunda yardım almak için 50 hayvan tesis ve F. Baldrey yönetim yardım almak için teknik destek, J. Hawkins ve personel Ulusal kurumları, Sağlık (NIH) bina. Onların kulak cilt diseksiyon protokolü, N. Burns Editör Yardım ve üyeleri kök hücre Laboratuvarı ve teknik yardım ve düşünceli tartışma için Neuro-vasküler Biyoloji paylaştığınız için teşekkür ederiz S. Motegi ve M. Udey. T. Yamazaki bilim promosyon (JSP’ler) NIH-KAITOKU için Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (Y.M. için HL005702-11), Intramural araştırma programı tarafından desteklenen
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
