Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren
Summary
Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.
Abstract
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll einer ganzen-Mount Erwachsene Ohr Haut imaging Technik um umfassende dreidimensionale Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Strukturierung sowie Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Analyse der peripheren Nerven und Blutgefäße anatomischen Strukturen in adulten Geweben bietet einige Einblicke in das Verständnis der funktionellen Neuro-vaskuläre Verkabelung und Neuro-vaskuläre Degeneration unter pathologischen Bedingungen wie z. B. die Wundheilung. Als sehr informativ Modellsystem haben wir unsere Studien auf Erwachsene Ohr Haut, konzentriert, die bei Dissektion gut zugänglich ist. Unsere einfache und reproduzierbare Protokoll sieht eine genaue Darstellung der zellulären Komponenten in der gesamten Haut, z. B. periphere Nerven (sensorische Axone, sympathischen Axone und Schwann-Zellen), Blutgefäße (Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen ), und Entzündungszellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die Möglichkeit, morphologischen Anomalien in der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Entzündung in der Haut von Erwachsenen Ohr unter verschiedenen pathologischen Bedingungen untersuchen ebnen wird.
Introduction
Haut besteht aus drei Schichten: der Epidermis, Dermis und Hypodermis. Es wurde als Modellsystem verwendet, um Stammzellen Wartung, Differenzierung und Morphogenese in Entwicklung als auch die Regeneration, Tumorgenese und Entzündung in der Erwachsenenbildung zu studieren. Haut ist reich durchblutet und innerviert, so dass die Entwicklung des peripheren Nervensystems und Gefäßsystem gut aufeinander abgestimmt ist.
Eine ganze-Mount embryonalen Haut bildgebendes Verfahren mit mehreren Kennzeichnung auf intakten peripheren Nerven und Blutgefäße einschließlich ihrer zellulären Komponenten1,2,3, zu studieren haben wir bereits gezeigt. 4: sensorische Axone, sympathischen Axone, Schwann-Zellen in den Nerven, Endothelzellen, Perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Blutgefäßen. Während die Angiogenese eine primäre Kapillarnetzes erfährt intensive vaskuläre remodeling und entwickelt sich zu einem hierarchischen vaskulären verzweigten Netzwerk. In den Entwicklungsländern Lederhaut/Unterhaut Arterien neben peripheren sensorischen Nerven und Adern verzweigen dann neben den Arterien bilden. Nachdem die hierarchische vaskuläre Netzwerk gründlich mit VSMCs bedeckt ist, sympathische Nerven erstrecken sich entlang und innervieren Großrohre Blutgefäße1,5,6. Trotz der Bedeutung in die enge Beziehung zwischen der Nerven- und Gefäßsystem Systeme entwickeln wurde eine wichtige Frage zu befassen, was passiert mit der Neuro-vaskuläre Netzwerke in verschiedenen pathologischen Situationen bei Erwachsenen. Eine dreidimensionale hochauflösende Bildgebung ist erforderlich, die Pathogenese, zusammen mit anatomisch erkennbaren Verzweigung Morphogenese und Musterung zu schätzen wissen.
Neuronale und vaskuläre Morphogenese in erwachsenen Maus Haut wird häufig durch Gewebe Abschnitt Färbung analysiert. Andere Studien haben ganze-Mount Bildgebung der Haut verwendet, um die peripheren Nerven und Blutgefäße, neben Arrector Pili Muskeln7,8,9, Haarfollikel und Talgdrüsen zu visualisieren. Allerdings hat die Dicke der Erwachsenen Haut, die Haut über seine gesamte Tiefe zu analysieren erschwert.
In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine neuartige hochauflösende ganze-Mount Imaging Erwachsene Ohr Haut, diese Herausforderungen zu meistern. Ohr Haut ist über seine gesamte Tiefe für die Dissektion und anschließende ganze-Mount-Bildgebung der Haut leicht zugänglich. So ist es eine einfache und hoch reproduzierbare Methode, die angewendet werden kann, um dreidimensionale Architektur der peripheren Nerven- und Gefäßsystem Systeme in der Haut, mit umfassender Quantifizierung Messungen zu vergleichen. Wir zeigten, dass die Ausrichtung der peripheren sensorischen und sympathischen Nerven mit großem Durchmesser Blutgefäße in der Erwachsenen Haut erhalten bleibt. Das Ziel dieses Protokolls ist, verzweigte Morphogenese und die Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene in erwachsenen Maus-Modellen in verschiedenen Erkrankungen wie Entzündungen zu visualisieren und Regeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die gesamte-Mount Immunonohistochemical Bildgebung Erwachsene Ohr Haut für die Analyse von Neuro-vaskuläre Strukturen und Immunzelle Verteilung. Wir glauben, dass diese Methode hat zahlreiche experimentelle Vorteile für Forscher, verzweigte Morphogenese und die Musterung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie dreidimensionale Verteilung der Haut-Komponenten einschließlich Immunzellen und Haare zu studieren Follikel. Die Ergebnisse der Bildgebung können mit imaging Software für weit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken K. Gill für die Labor-Management und technische Unterstützung, J. Hawkins und das Personal des National Institute of Health (NIH) 50 Tierhaus für die Unterstützung bei der Maus Pflege und R. Reed und F. Baldrey für die Amtshilfe. Vielen Dank auch an S. Motegi und M. Udey für ihr Ohr Haut Dissektion Protokoll, N. Burns für redaktionelle Hilfe und Mitglieder von Labor Stem Cell und Neuro-vaskuläre Biologie für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. T. Yamazaki wurde von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU unterstützt. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschungsprogramm von der National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11, Y.M) unterstützt.
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
