Hela-mount konfokalmikroskopi för vuxna öron hud: modellsystem studera Neuro-vaskulär förgrenade morfogenes och immunceller Distribution
Summary
Här beskriver vi en hög upplösning hela-mount bildgivande metod i hela vuxen mus öra huden, vilket gör det möjligt för oss att visualisera förgrenade morfogenes och mallning av perifera nerver och blodkärl, samt immunceller distribution.
Abstract
Här presenterar vi ett protokoll av en hela-mount vuxen öra hud bildteknik för att studera omfattande tredimensionell neuro-vaskulär förgrenade morfogenes och mallning, samt immunceller distribution på cellnivå. Analysen av perifer nerv och blodkärl anatomiska strukturer i vuxna vävnader ger viss insikt i förståelsen av funktionella neuro-vaskulär ledningar och neuro-vaskulär degeneration i sjukdomstillstånd såsom sårläkning. Som mycket informativ modellsystem, har vi fokuserat våra studier på vuxna öra huden, som är lätt åtkomlig för dissektion. Vår enkla och reproducerbara protokollet ger en exakt skildring av de cellulära komponenterna i hela huden, såsom perifera nerver (sensoriska axoner, sympatiska axoner och Schwann celler), blodkärl (endotelceller och vaskulära glatta muskelceller ), och inflammatoriska celler. Vi anser att detta protokoll kommer att bana väg att undersöka morfologiska abnormiteter i perifera nerver och blodkärl samt inflammation i vuxen öra huden under olika sjukdomstillstånd.
Introduction
Huden består av tre lager: epidermis, dermis och hypodermis. Det har använts som ett modellsystem studera stamceller underhåll, differentiering och morfogenes i utveckling samt förnyelse, uppkomst och inflammation i vuxen. Huden är rikligt vaskulariserad och innerveras så att utvecklingen av det perifera nervsystemet och kärlsystemet är väl samordnad.
Vi har tidigare visat en hela-mount embryonal hud bildteknik med flera märkning för att studera intakt perifera nerver och blodkärl inklusive deras cellulära komponenter1,2,3, 4: sensoriska axoner, sympatiska axoner, Schwann celler i nerver, endotelceller, pericyter och vaskulära glatta muskelceller (VSMCs) i blodkärl. Under angiogenes, en primär kapillär nätverket genomgår intensiv vaskulär remodeling och utvecklas till en hierarkisk vaskulär förgrenade nätverk. I utveckla dermis/hypodermisna, artärer filial tillsammans med perifera sensoriska nerver och vener sedan bilda anslutning till artärerna. Efter det hierarkiska vaskulär nätverket är ordentligt täckt med VSMCs, sympatiska nerver sträcker sig längs och innerverar blodkärlen stor diameter1,5,6. Trots betydelsen i det nära samarbete mellan utvecklingsländer nervös och vaskulära system varit en viktig fråga att ta itu med vad som händer med de neuro-vaskulära nätverk i olika patologiska situationer på vuxna. En tredimensionell högupplöst avbildning är nödvändigt att uppskatta patogenes, tillsammans med anatomiskt igenkännliga förgrenade morfogenes och mallning.
Neuronala och vaskulär morfogenes i vuxen mus huden analyseras vanligen genom vävnaden avsnitt färgning. Andra studier har använt hela-mount avbildning av huden för att visualisera perifera nerver och blodkärl, förutom hårsäckar, talgkörtlar och arrector pili muskler7,8,9. Tjockleken på vuxen hud har dock gjort det svårt att analysera huden över dess hela djup.
I den aktuella studien, har vi utvecklat en roman högupplösta hela-mount avbildning av vuxen öra hud att övervinna dessa utmaningar. Öra hud är lätt åtkomliga för dissekering och efterföljande hela-mount avbildning av huden över dess hela djup. Det är därför en okomplicerad och mycket reproducerbar metod som kan användas för att jämföra tredimensionella arkitektur av perifera nervsystemet och vaskulära system i huden, med omfattande kvantifiering mätningar. Vi visat att anpassningen av perifera sensoriska och sympatiska nerver med stor diameter blodkärl bevaras i vuxen huden. Målet med detta protokoll är att visualisera förgrenade morfogenes, och mönstringen av perifera nerver och blodkärl, samt immunceller fördelningen på cellnivå i vuxen musmodeller i olika förhållanden såsom inflammation och förnyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver det hela-mount immunonohistochemical avbildning av vuxen öra hud för analys av neuro-vaskulära strukturer och immunceller distribution. Vi anser att denna metod har många experimentella fördelar för forskare att studera förgrenade morfogenes och mönstringen av perifera nerver och blodkärl samt tredimensionell distribution av huden komponenter inklusive immunceller och hår folliklar. Resultaten av imaging kan kvantifieras med tänkbar mjukvaran för ytterligare kvantitativ analys.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar K. Gill för laboratoriet förvaltning och teknisk support, J. Hawkins och personalen av National Institutes of Health (NIH) bygga 50 djuranläggningen för hjälpen med mus-och sjukvård, och R. Reed och F. Baldrey för administrativt stöd. Tack också till S. Motegi och M. Udey för deras öra hud dissektion protokoll, N. brännskador för redaktionell hjälp, och medlemmar av laboratorium av stamcellen och Neuro-vaskulär biologi för teknisk hjälp och tankeväckande diskussion. T. Yamazaki stöddes av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) NIH-KAITOKU. Detta arbete stöds av intramurala forskningsprogrammet av nationella hjärtat, lungorna och blodet Institute (HL005702-11 till Y.M.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
