Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta
Summary
Descriviamo le prove meccaniche simultanea e live imaging 3D della parete arteriosa di isolato, arterie di resistenza umana e Fiji e Ilastik analisi di immagine per la quantificazione di elastina e collagene densità di volume e di organizzazione spaziale. Discutiamo l’uso di questi dati in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa.
Abstract
Il contributo di patogeno della resistenza dell’arteria rimodellamento è documentato nell’ipertensione essenziale, il diabete e la sindrome metabolica. Le indagini e lo sviluppo di modelli matematici microstructurally motivati per comprendere le proprietà meccaniche delle arterie di resistenza umana nella salute e nella malattia hanno il potenziale per aiutare la comprensione come malattia e trattamenti medici influenzare la microcircolazione umana. Per sviluppare questi modelli matematici, è essenziale per decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare. In questo lavoro, descriviamo un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e simultaneo imaging tridimensionale privo di etichetta della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per quantificare le modifiche i) pressione indotta in angoli ramificazione lamina elastica interna e rettilineità adventitial collagene utilizzando Fiji e densità di volume ii) collagene ed elastina determinato utilizzando il software Ilastik. Preferibilmente tutte le misure di formazione immagine e meccaniche vengono eseguite sulle arterie live, irrorate, tuttavia, è un approccio alternativo utilizzando pressione standard video-microscopia myography in combinazione con post-fissazione formazione immagine dei vasi ri-pressurizzati discussi. Questo metodo alternativo fornisce agli utenti con diverse opzioni per approcci di analisi. L’inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa, e lo sviluppo futuro e aggiunte al protocollo sono proposti.
Introduction
Il contributo patogeno e gli effetti della resistenza dell’arteria rimodellamento sono documentati nell’ipertensione essenziale, diabete e sindrome metabolica1,2,3,4,5. Decifrare il rapporto tra le proprietà meccaniche e della microarchitettura della parete microvascolare è essenziale per lo sviluppo di modelli matematici di questa associazione. Tali modelli miglioreranno la comprensione del processo di rimodellamento e sosterranno lo sviluppo di modelli di silico utile per testare strategie farmacologiche malattia targeting relativo rimodellamento della parete arteriosa.
Precedenti studi focalizzati a comprendere come la microarchitettura della parete arteriosa si riferisce alla meccanica della parete arteriosa incorporando misure meccaniche e la microarchitettura della matrice extracellulare (ECM) vengono eseguite quasi esclusivamente su grande , le arterie elastiche condotto da topi o suina6,7,8,9,10,11. Formazione immagine di microstrutture della parete viene in genere eseguita utilizzando tecniche ottiche non lineari, approfittando del autofluorescence di elastina e di generazione di seconda armonica da collagene. In questo modo spatiotemporal imaging dei due componenti principali della matrice extracellulare, elastina e collagene, senza la necessità di macchiatura. Imaging della parete arteriosa in tutto il suo spessore è una sfida nelle arterie di grande condotto a causa di dispersione della luce nella spessa tunica media. Tuttavia, per determinare la correlazione tra la microarchitettura delle componenti strutturali della parete arteriosa e le proprietà meccaniche osservate, informazioni tridimensionali devono essere ottenuti durante le prove meccaniche. Per grandi arterie come l’aorta umana, questo richiede montaggio biassiale, prove meccaniche e imaging delle regioni di interesse in pezzi di2 : 1-2 cm della parete arteriosa7,9,10, 12. solo una parte del muro può essere imaged e meccanicamente testata.
Per più piccole arterie di qualsiasi specie (ad es., pericardico umano13, polmonare14 e sottocutaneo15 arterie, ratto arterie mesenteriche16,17,18, 19 , 20, mouse cremaster, mesenterico, cerebrale, femorale e arterie carotiche21,22,23,24,25,26, 27) imaging dello spessore della parete intera è possibile e può essere combinato con prove meccaniche. Questo permette la registrazione simultanea di proprietà meccaniche e i dispositivi strutturali all’interno della parete. Tuttavia, una modellazione matematica diretta della relazione tra le alterazioni osservate nella struttura tridimensionale della ECM e cambiato proprietà meccaniche della parete arteriosa resistenza, è al meglio della nostra conoscenza solo stato segnalato su recentemente in resistenza umana arterie13,15.
In questo lavoro, è descritto un metodo ex vivo per prove meccaniche passive e formazione immagine tridimensionale simultanea della microarchitettura di elastina e collagene nella parete arteriosa delle arterie di resistenza umana isolata. Il protocollo di imaging può essere applicato alle arterie di resistenza di qualsiasi specie di interesse. Analisi di immagine sono descritti per ottenere misure di angoli ramificazione lamina elastica interna e collagene adventitial rettilineità13 utilizzando Fiji28. Densità di volume di collagene ed elastina sono determinati utilizzando Ilastik software29 e infine, l’inclusione dei dati meccanici e imaging in modelli matematici della meccanica della parete arteriosa è discussa.
L’obiettivo di descrivere le analisi di imaging e immagine tecniche in combinazione con modellazione matematica è quello di fornire gli investigatori un approccio sistematico per descrivere e comprendere osservato cambiamenti di pressione indotta nel ECM di arterie di resistenza. Il metodo descritto è focalizzato nel quantificare i cambiamenti in ECM in una nave durante la pressurizzazione, confrontando la struttura dell’ECM a 20, 40 e 100 mmHg. Queste pressioni sono stati scelti per la determinazione della struttura della parete arteriosa al suo più compatibile (20 mmHg), rigido (100 mmHg) e stato intermedio (40 mmHg), rispettivamente. Tuttavia, qualsiasi processo nella parete vascolare delle arterie dal vivo, tra cui i cambiamenti indotti da componenti vasoattivi, isteresi e flusso, può essere quantificato, a seconda l’ipotesi di ricerca in questione dallo sperimentatore.
L’uso di microscopia di fluorescenza del due-fotone eccitazione (TPEM) in combinazione con un myograph di pressione per lo studio di pressione (o altro) ha indotto cambiamenti in ECM delle arterie dal vivo è data risalto a. In primo luogo, perché questo consente acquisizione simultanea della struttura nel complesso tridimensionale della parete arteriosa (diametro e spessore della parete) con acquisizione tridimensionale privo di etichetta di alta qualità, immagini del collagene e dell’elastina dettagliate microarchitetture come descritto13 sfruttando l’autofluorescenza di elastina e collagene seconda generazione armonica segnale (SHG)30. In secondo luogo, TPEM consente è consentito l’uso della luce di eccitazione di bassa energia vicino infrarosso, minimizzando photodamage di tessuti e dunque, formazione immagine ripetuta esattamente nella stessa posizione all’interno della parete vascolare, che consente analisi di misure ripetute di osservato modifiche.
L’uso di un approccio alternativo usando la formazione immagine confocal di pressione fissata arterie è discusso per consentire agli utenti senza accesso ai TPEM l’opportunità di utilizzare il metodo descritto pure. Informazioni sulla densità di struttura e volume di ECM possono essere recuperate anche dalle analisi bidimensionale dei tessuti sezionati in serie, ad esempio come descritto da31,32. Tuttavia, a causa della mancanza di possibilità di recuperare informazioni strutturali tridimensionali sopra le scale di lunghezza dell’arteria, così come durante il cambiamento delle condizioni di utilizzo di questo metodo, si consiglia di non utilizzare questo approccio per le indagini di pressione e il trattamento ha indotto cambiamenti tridimensionale in ECM.
Il requisito minimo per l’investigatore applicare il metodo qui descritto è l’accesso a un programma di installazione per inserimento di una canula e pressurizzazione delle arterie in combinazione con un microscopio a fluorescenza confocale o due-fotone eccitazione. Il programma di installazione descritto nel protocollo seguente è un myograph di pressione su misura con un trasduttore di forza longitudinale, costruito per adattarsi su un microscopio di fluorescenza di eccitazione del due-fotone costruito su ordinazione invertito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro rappresenta la nostra proposta per un standardizzato combinato imaging e pressione myography approccio, prezioso per la valutazione simultanea delle proprietà meccaniche di resistenza arterie e pressione relativi cambiamenti nella struttura dell’arterioso parete in un intervallo di pressione da 0 a 100 mmHg. L’approccio presentato è stato sviluppato utilizzando attrezzature costruzione personalizzata, tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi myograph di pressione che si inserisce su un microscopio di fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il centro di Imaging biomedico di danese molecolare presso la facoltà di scienze naturali, Università della Danimarca meridionale, per l’utilizzo di laboratori e microscopi. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior sono riconosciuti per l’eccellente assistenza tecnica con la pressione myography e imaging.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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