Method Article

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

DOI:

10.3791/57465

⸱

March 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעגל retinotectal של ראשן צפרדע רפואית מורכבת של תאי גנגליון (RGCs) בעיניים איזו תבנית synapses ישירות על גבי נוירונים בריכוזים tectum סיב אופטי, הוא מודל פופולרי ללמוד את המעגלים העצביים איך להתחבר בעצמם. היכולת לבצע כל תא הקלטות מלחציים תיקון הנוירונים tectal ואליהן הרשומה מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות, גם אין ויוו או באמצעות הכנה כל המוח, יצר גוף גדול של נתונים ברזולוציה גבוהה על המנגנונים שבבסיס נורמלי , חריג, מעגל היווצרות ואת הפונקציה. כאן נתאר כיצד לבצע ויוו ההכנה, הכנת כל המוח המקורי, ופיתח יותר לאחרונה המוח אופקי פרוסה לקראת קבלת התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים tectal. בכל אופן ההכנה יתרונות ייחודיים ניסיוני. הכנת ויוו מאפשר ההקלטה של התגובה הישירה של הנוירונים tectal לגירויים חזותיים מוקרנת העין. הכנת כל המוח מאפשר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר להיות מופעל בצורה מאוד מבוקרת, הכנת פרוסה אופקי המוח מאפשר הקלטה של-פני כל שכבות של tectum.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעגל retinotectal הוא המרכיב העיקרי של מערכת הראייה דו-חיים. הוא מורכב RGCs בעיניים, אשר פרויקט אקסונים שלהם כדי tectum אופטיים שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים tectal postsynaptic. המעגל retinotectal ראשן צפרדע רפואית הוא מודל התפתחותי פופולרי ללמוד מעגלים עצביים היווצרות ותפקוד. ישנן תכונות רבות של מעגל retinotectal של ראשן הזה להפוך אותו דגם ניסיוני עוצמה1,2,3. תכונה אחת הגדולות, המוקד של מאמר זה, היא היכולת לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, בתוך vivo או באמצעות הכנה כל המוח. עם מתקן קידוח אלקטרופיזיולוגיה לבוש עם מגבר התומך מתח,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ויומינג. כל ההליכים, כולל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, מתבצעות בטמפרטורת החדר, כ 23 ° C. כל השיטות המתוארות כאן ממוטבים עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15).

1. הכנה in Vivo

  1. עזים ומתנגד את הראשן.
    1. מקם את הראשן בצלוחית קטנה המכילה הפתרון של שטיינברג עם 0.01% MS-222 במשך כ 5 דקות.
      הערה: MS-222 aka "Tricaine" הוא דגים, דו-חיים הרדמה נפוץ. הראשנים מגודלים בפתרון של שטיינברג במ מ: 0.067 אשלגן כלורי, 0.034 Ca (3)2•4H2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקליט אור-עורר תגובות כל השדה הבזק של אור מוקרן על הרשתית בזמן התגובה מתועד של נוירונים בודדים tectal (איור 4א). פרוטוקול מסוים זה תוכנן כדי למדוד את התגובה של הנוירון אל האור מגרה ("על" תגובה), ואז ביטול 15 s מאוחר יותר כדי למדוד את "את התגובה." הנוירונים tectal בדרך כלל מוצג חזקים תגובות לסירוגין (מצב קלאמפ שמוצג כאן מתח שהוקלט ב, עם הנוירון כשכרטיס ל- 60mV כדי למדוד זרם סינפטית (איור 4B)).......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות בעבודה זו אופטימיזציה עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15). ובבמה 42, הראשנים הם גדול מספיק ולא מספיק מפותח כך ניתן למקם את הסיכות חרקים משני צידי המוח להקלטות ויוו , שבצעתי את הקרע כל המוח. בשלבים מוקדמים יותר, כאשר הראשנים הם בעצם דו מימדי (קרי, שטוח), הגישות המתוארים כאן אינם מיטביים.

בשל הקלות שבה הנוירונים tectal ניתן לגשת להקליט ולצפות בתצורת התא כולו, היה מעגל זה מודל חמ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתמך על ידי המענק-NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
סטמי סטריאו 508זייס495009-0006-000 ניתוח מיקרוסקופ
MS-222 "Tricane"FinquelARF5Gדו-חיים הרדמה כללית
נתרן כלורי (NaCl)Fisher ScientificS271-3משמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
אשלגן כלורי (KCl)Fisher ScientificP217-500משמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGמשמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
סידן חנקתי טטרהיראט (Ca(NO3)• 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500Gמשמש להכנת התמיסה של Stienberg   
מגנזיום גופרתי (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04משמש להכנת תמיסת שטיינברג
סידן כלוריד (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500Gמשמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
מגנזיום כלוריד (MgCl2)J.T. Baker2444-01משמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
D-גלוקוז נטול מיםMallinckrodt כימיקלים6066-04משמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379אנטגוניסט קולטן אצטילכולין ניקוטיני
סיכות חרקיםFine Science Tools26002-10סיכות נירוסטה בקוטר 0.1 מ"מ
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning761028ערכת מונומר וחומר ריפוי בשקילה מראש
צלחת פטרי פוליסטירן סטרילית - 60x15 מ"מפישר סיינטיפיקAS4052צלחות פטרי קטנות
מחט PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5 מ"מ X 16 מ"מ)305122מחטי מזרק
1 מ"ל קצה החלקה מזרק טוברקולין BD309659מזרקים חד פעמיים, סטריליים
בורוסיליקט פיפטה זכוכיתסאטר מכשיר SUTTERBF150-86-10HPנמשך למפרט הרצוי באמצעות מכונת משיכת פיפטה
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter InstrumentsP-97מייצר מיקרופיפטות להקלטת אלקטרופיזיולוגיה מגבוני
Kimwipes KimtechKimberly-Clark34120עדין מגבים נטולי מוך משימה
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7Bהתקנים מולקולריים1-CV-7Bמהדק זרם ומהדק מתח
MP-285 מניפולטור ממונע עם בקר שולחןסאטרMP-285/Tבקרת ראש על מתקן אלקטרופיזיולוגיה
LED מצמד סיבים (ירוק)ThorlabsM530F2כבל סיבים אופטיים בשילוב עם LED ירוק
אלקטרודה דו-קוטבית של אשכול (25µ קוטר מ')FHC30207אלקטרודה מגרה דו-קוטבית
ISO-Flex סטימולטורA.M.P.I. (ישראל) צור קשר עם יצרןמבודד גירוי גמיש
Axon Instruments 700B Multipatch Ampliifierהתקנים מולקולריים2500-0157מגבר להקלטת מהדק מתח וזרם 
Digidata 1322A דיגיטייזרמכשירים מולקולריים2500-135מערכת רכישת נתונים לרישום אלקטרופיזיולוגיה
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 מיקרוסקופ לאלקטרופיזיולוגיה
שולחן מעבדה מיקרו-gTMC63-533שולחן אוויר למיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה
Inspiron 620 מחשב שולחני אישי עם Windows 7 64 סיביותDellD06D001מחשב הפועל תוכנת אלקטרופיזיולוגיה
c2400 מצלמת CCDHamamatsu70826-5מצלמת מכשיר מצמד טעינה להדמיית אלקטרופיזיולוגיה
O'Clock סופר פלטינה סכיני גילוח אל חלדג'ילטCMM01049סכיני גילוח אל חלד מצופים פלטינום
צנרת העברה פישרסיינטיפיק13-711-7Mצינורות העברת פוליאתילן חד פעמיים
BD מכשיר 7

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole Cell Patch ClampXenopus Laevis Tectal NeuronsIn Vivo PreparationWhole Brain PreparationHorizontal Brain SliceOptic Tectum RecordingsRetinal Ganglion Cell ActivationBipolar Stimulating ElectrodeSilicone Elastomer BlockExternal Recording Solution

Related Articles