ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה
Summary
בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.
Abstract
המעגל retinotectal של ראשן צפרדע רפואית מורכבת של תאי גנגליון (RGCs) בעיניים איזו תבנית synapses ישירות על גבי נוירונים בריכוזים tectum סיב אופטי, הוא מודל פופולרי ללמוד את המעגלים העצביים איך להתחבר בעצמם. היכולת לבצע כל תא הקלטות מלחציים תיקון הנוירונים tectal ואליהן הרשומה מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות, גם אין ויוו או באמצעות הכנה כל המוח, יצר גוף גדול של נתונים ברזולוציה גבוהה על המנגנונים שבבסיס נורמלי , חריג, מעגל היווצרות ואת הפונקציה. כאן נתאר כיצד לבצע ויוו ההכנה, הכנת כל המוח המקורי, ופיתח יותר לאחרונה המוח אופקי פרוסה לקראת קבלת התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים tectal. בכל אופן ההכנה יתרונות ייחודיים ניסיוני. הכנת ויוו מאפשר ההקלטה של התגובה הישירה של הנוירונים tectal לגירויים חזותיים מוקרנת העין. הכנת כל המוח מאפשר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר להיות מופעל בצורה מאוד מבוקרת, הכנת פרוסה אופקי המוח מאפשר הקלטה של-פני כל שכבות של tectum.
Introduction
המעגל retinotectal הוא המרכיב העיקרי של מערכת הראייה דו-חיים. הוא מורכב RGCs בעיניים, אשר פרויקט אקסונים שלהם כדי tectum אופטיים שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים tectal postsynaptic. המעגל retinotectal ראשן צפרדע רפואית הוא מודל התפתחותי פופולרי ללמוד מעגלים עצביים היווצרות ותפקוד. ישנן תכונות רבות של מעגל retinotectal של ראשן הזה להפוך אותו דגם ניסיוני עוצמה1,2,3. תכונה אחת הגדולות, המוקד של מאמר זה, היא היכולת לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, בתוך vivo או באמצעות הכנה כל המוח. עם מתקן קידוח אלקטרופיזיולוגיה לבוש עם מגבר התומך מתח, זרם-להדק מצבי הקלטה, הקלטות מלחציים תיקון כל התא לאפשר אלקטרופיזיולוגיה של נוירון להיות מאופיין ברזולוציה גבוהה. כתוצאה מכך, התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal ברחבי השלבים המפתח של היווצרות מעגל retinotectal סיפקו הבנה מפורט ומקיף של ההתפתחות ואת הפלסטיות של מהותי4,5 , 6 , 7 וסינפטית8,9,10,11 נכסים. שילוב כל התא תיקון קלאמפ נוירון tectal הקלטות, היכולת לבטא את הגנים או morpholinos עניין הנוירונים האלה12, שיטה להערכת התנהגות מודרכים חזותי באמצעות בדיקה הימנעות חזותי הוקמה13 מקדמת זיהוי של קישורים בין מולקולות, מעגל פונקציה התנהגות.
חשוב לציין כי הסוג ברזולוציה גבוהה נתונים שנרכשה מן התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות אינה אפשרית באמצעות גישות הדמיה חדשות יותר כמו מחוון סידן גנטית GCaMP6, כי למרות באמצעות מחווני סידן מתירה ההדמיה של סידן dynamics על פני אוכלוסיות גדולות של נוירונים בו זמנית, לא ישיר או דרך ברור כי הפרמטרים חשמלי מסוים יכולה להיות מושגת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית דלתא, somata, אין שום דרך מתח מלחציים נוירון כדי למדוד זרם-מתח מערכות יחסים. ברור אלה שתי גישות שונות, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה, בעלי עוצמות שאינם חופפים, ליצור סוגים שונים של נתונים. לפיכך, הגישה הטובה ביותר תלויה השאלה ניסיוני ספציפית נותרים ללא מענה.
כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו לרכישת כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectum אופטיים ראשן, שימוש ויוו הכנה, הכנה כל המוח, ושינית וחדש יותר הכנה כל המוח שפותחה במעבדתנו14 . במקטע תוצאות נציג, נדגים את היתרונות ניסיוני של כל הכנה, סוגים שונים של נתונים שניתן להשיג. הגבולות ואת החוזק של תכשירים שונים, כמו גם עצות לפתרון בעיות, כלולים במקטע דיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כל השיטות המתוארות בעבודה זו אופטימיזציה עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15). ובבמה 42, הראשנים הם גדול מספיק ולא מספיק מפותח כך ניתן למקם את הסיכות חרקים משני צידי המוח להקלטות ויוו , שבצעתי את הקרע כל המוח. בשלבים מוקדמים יותר, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי המענק-NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
